黄芩苷干预鸡毒支原体感染所致炎症损伤的分子机制

摘要

鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum，MG）是一种在全球范围内广泛存在的，可引起禽类慢性呼吸道病的一种病原微生物，属于支原体属。该病感染阳性率极高，在不继发感染的情况下死亡率较低，MG感染后，一般会引起饲料利用率降低，肉鸡的体重下降，以及造成雏鸡淘汰率上升，成年母鸡产蛋率下降等问题，给养禽业带来巨大的经济损失。临床上常见与其他疾病混合感染或由饲养管理不善、环境突变等因素引起的应激而导致MG的爆发，对禽类养殖业危害极大。由于支原体没有细胞壁结构，所以作用于细胞壁的抗生素对治疗本病无效，导致可选择的抗生素种类受限，加之抗生素的不合理使用，使得该病的药物研发尤为重要。 中药组方治疗是根据MG的主要发病机制，以扶正祛邪为根本，达到标本兼治的目的，在临床实践中有很好的疗效，成为目前MG防治药物研发的热点方向。其中，黄芩苷是提取自中药黄芩根部的活性成分，国内外对该药物的研究十分重视。现代医学的大量研究表明黄芩苷具有明显的抗炎作用，能够有效抑制炎症反应的发生。对于黄芩苷作用机制的研究可以促进该药物的进一步发展及其在MG感染治疗方面的应用。 本研究首先根据已有的MG感染模型的建立方法，利用被广泛认可的四种评价手段(SPA评分、格罗斯气囊病变评分、气管病变评分、气管黏膜厚度)，对四种不同的感染方式（滴鼻点眼感染、气囊接种感染、混合感染、氢化可的松诱导感染）进行平行比较。结果显示以5×109CCU/mL的MG R株菌液用气囊接种的方法感染7日龄雏鸡，能够在感染后5 d观察到MG感染的典型临床症状，病程发展速度适中，适合用于本研究的后续治疗试验。 在黄芩苷治疗试验中，用确立好的MG感染模型构建方法，根据其病程发展特点，于感染后第三天开始将黄芩苷混于水中饲喂治疗，剂量为1.5g/只·d，持续7d。分别于饮水饲喂治疗后1、4、7d剖检采样，采用ELISA、透射电镜和Western Blot、Real Time-PCR等分子生物学技术，探讨黄芩苷对MG感染造成的炎症相关基因表达的影响以及在TLR2/NF-κB通路中p65蛋白扮演的角色。 病理学和超微结构观察结果:通过病理学临床表现的格罗斯气囊病变评分、气管病变评分和SPA评分可见在经过黄芩苷混水饲喂治疗7d后能够降低靶器官受到的组织损伤，病变程度明显减轻，且有统计学差异。利用透射电镜观察肺和气管细胞的超微结构时可以看到，MG感染组气管部位纤毛细胞固缩退化，脱落坏死。肺部组织中，肺泡Ⅰ型上皮细胞损伤严重，胞质破碎。黄芩苷治疗组主要表现为纤毛肿胀，顶端形成蘑菇状水肿泡，有纤毛相互融合的现象，肺泡Ⅰ型上皮细胞损伤明显减轻。由此可见黄芩苷治疗试验可以有效改善MG感染所带来的组织和细胞炎症损伤。 炎症相关因子和p65蛋白的表达结果:感染后4d，MG感染组与空白对照组相比经ELISA试剂盒检测炎性因子IL-1β、TNF-α表达量明显升高;Western Blot检测TLR2和P-p65蛋白含量同样显著升高(P＜0.05)并于感染后7 d达到峰值，此时IL-1β、TNF-αmRNA的表达量也呈现出爆发性增长(P＜0.01);感染后10 d，炎性因子和相关蛋白表达量有所下降。相比较于MG感染组，黄芩苷治疗组在给药1、4、7 d后，炎性因子IL-1β、TNF-α表达量显著下降(P＜0.01)且相应蛋白TLR2和P-p65的表达量也明显低于MG感染组。 综上，本试验在评价四种鸡毒支原体感染方式的基础上，用浓度为5×109 CCU/mL的MGR株菌液0.2 mL以气囊接种的方式感染7日龄雏鸡的模型进行黄芩苷抗MG感染作用及机理的研究。结果表明，黄芩苷能够通过抑制MG感染时炎性因子IL-1β、TNF-α的释放，干预MG感染造成的炎症损伤。同时，黄芩苷也能够通过抑制p65蛋白的磷酸化，干预TLR2-NFκB信号通路的活化，进而影响炎性因子的表达。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 鸡毒支原体(MG)的相关研究

1．1．1 MG的发病情况和危害

1．1．3 MG的发病机制

1．1．4 MG的炎症损伤

1．1．5 MG的诊断方法

1．1．6 MG的防治

1．2 MG感染模型的研究进展

1．2．1 MG感染模型的建立方法

1．2．2 MG感染模型的评价方法

1．3 中药治疗MG病及黄芩苷药理作用

1．3．1 中医理论辩证MG感染的病理机制

1．3．2 中药组方干预MG的研究进展

1．3．3 黄芩苷的药理作用

1．4 本研究的目的与意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 菌株、药物及试验动物

2．1．2 主要仪器

2．1．3 主要试剂

2．1．4 相关试剂的配制

2．2 MG感染模型的确立方法

2．2．1 菌株培养

2．2．2 实验分组与感染方法

2．2．3 SPA检测

2．2．4 格罗斯气囊病变与病理学评分

2．2．5 肺和气管病理切片与HE染色

2．3 黄芩苷对MG造成炎症损伤的干预效果

2．3．1 菌株培养

2．3．2 实验分组与治疗

2．3．3 血清学实验

2．3．4 格罗斯气囊病变与病理学评分

2．3．6 炎性因子IL-1β，TNF-α的mRNA表达水平检测

2．3．7 透射电子显微镜观察超微结构

2．4 数据处理与分析

3 结果与分析

3．1 MG感染模型的确立

3．1．1 四种感染方法中雏鸡临床症状的差异

3．1．2 四种感染方法中雏鸡血清学表现的差异

3．1．3 四种感染方法中雏鸡组织病理学的差异

3．1．4 四种感染方法中雏鸡细胞病理学的差异

3．2 黄芩苷对MG造成炎症损伤的干预效果

3．2．1 黄芩苷对MG造成炎症损伤的临床症状的影响

3．2．2 黄芩苷对MG造成炎症损伤的血清学变化的影响

3．2．3 黄芩苷对MG造成炎症损伤的病理变化的影响

3．2．4 黄芩苷对MG造成炎症损伤产生的炎性因子的影响

3．2．5 黄芩苷对MG造成炎症损伤时TLR2受体与相关通路表达的差异

4 讨论

4．1 鸡毒支原体感染模型的确立

4．2 黄芩苷对MG感染造成炎症损伤的干预效果

4．3 黄芩苷干预MG感染的分子机制与TLR2-NFκB信号通路的关系

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文