原等跳成虫肠道细菌的分离鉴定及降解纤维素细菌的筛选

摘要

跳虫是一类微小型土壤动物，与线虫、螨虫构成土壤动物三大优势类群，具有重要的生态价值。跳虫取食地面的枯枝落叶，真菌菌丝及腐殖质等，它与环境中的微生物共同作用，促进生态系统中物质和能量的相互转化:跳虫取食土壤中的大分子碳源物质后，经过肠道微生物与自身酶系统相互作用，将大分子碳源物质转化为小分子可被利用的有机物，一部分用于维持自身的生长所需，另一部分以排泄的方式，将有机物归还到土壤中或以二氧化碳等气体的形式归还到大气中。跳虫发挥其生态功能的基础依赖于自身复杂的肠道微生物结构及多样性。
　　本研究基于跳虫的生态作用和食性特点，以原等跳Proisotoma ananevae成虫为实验材料，研究其肠道细菌结构及多样性，并筛选肠道内降解纤维素细菌。首先，本研究采用传统培养分离方法及16S rRNA基因系统发育分析研究原等跳P.ananevae成虫肠道内可培养细菌结构。然后，运用高通量测序方法基于16S rRNA基因建库进一步分析跳虫肠道细菌的结构及多样性。最后，通过羧甲基纤维素钠筛选培养基(CMC)筛选可培养细菌中，能够降解纤维素的细菌并采用3，5-二硝基水杨酸(DNS)法测定不同pH(pH5.0-9.0)培养基下纤维素酶活力。结果如下:
　　传统的培养分离方法结合16S rRNA基因系统发育分析，共分离到原等跳P.ananevae成虫肠道细菌20株。它们隶属于厚壁菌门Firmicutes，变形菌门Proteobacteria，放线菌门Acinobacteria3门，葡萄球菌属Staphylococcus，芽孢杆菌属Bacillus，Terribacillus，Advenella，赖氨酸芽孢杆菌属Lysinibacillus，节杆菌属Arthrobacter，肠杆菌属Enterobacter，Glutamicibacter，无色杆菌属Leucobacter和不动杆菌属Acinetobacte10属。其中厚壁菌门Firmicutes，变形菌门Proteobacteria为该方法分离到的优势类群。
　　高通量测序方法共共获得原等跳虫P.ananevae成虫肠道细菌27个OTUs。它们属于4门5纲11目17科20属。即变形菌门Proteobacteria，厚壁菌门Firmicutes，拟杆菌门Bacteroidetes和放线菌门Acinobacteria四门，其中变形菌门Proteobacteria和厚壁菌门Firmicutes为肠道优势细菌分别占总细菌数量的54％和31％。20属分别为葡萄球菌属Staphylococcus，芽孢杆菌属Bacillus，几丁单胞菌属Chitinimonas，Terribacillus，Advenella，赖氨酸芽孢杆菌属Lysinibacillus，节杆菌属Arthrobacter，肠杆菌属Enterobacter，Glutamicibacter，无色杆菌属Leucobacter，不动杆菌属Acinetobacter，嗜甲基菌属Methyloversatilis，气单胞菌属Aeromonas，短杆菌属Brevibacterium，乳酸杆菌属Lactobacillus，绿脓单胞菌属Pseudomonas，类土地杆菌属Parapedobacter，埃肯菌属Eikenella，Marmoricola和Hydrogenophaga。在种的层次上共注释到7种细菌Chitinimonas taiwanensis，Staphylococcus sciuri subsp.sciur，Hydrogenophaga pseudoflava，纺锤形赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus fusiformis，苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis，蜡样芽胞杆菌Bacillus cereus和Enterobacter ludwigii。在属的层次上葡萄球菌属Staphylococcus，芽孢杆菌属Bacillus和肠杆菌属Enterobacter三属为优势类群。
　　跳虫肠道可培养细菌降解纤维素菌株筛选结果表明:10株降解纤维素细菌分属6属，即Leucobacter，芽孢杆菌属Bacillus，Terribacillus，赖氨酸芽孢杆菌属Lysinibacillus，节杆菌属Arthrobacter和Glutamicibacter。不同pH值培养基下纤维素酶活力实验结果显示，所有纤维素降解菌株在pH7.0-9.0之间纤维素酶活性均相对较高，且pH8.0时酶活力最高。
　　以上结果说明，原等跳P.ananevae成虫肠道内存在复杂的细菌结构并且有一定比例的降解纤维素细菌，这些细菌在偏碱性条件下纤维素酶活力要高于酸性条件下酶活力;跳虫作为生态系统中的分解者，其肠道内大量降解纤维素细菌的存在，不仅有助于跳虫利用环境中的大分子有机物满足自身的营养等需要，同时对于饲料及工业生产也具有一定的应用价值。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1．1 跳虫的国内外研究现状

1．1．2 跳虫的分类地位

1．2 六足总纲肠道细菌研究概述

1．3 肠道微生物的主要研究方法

1．3．1 肠道细菌的传统培养与分离方法

1．3．2 肠道微生物的分子生物学研究方法

1．4 肠道微生物的研究意义

1．5 本课题研究的目的及意义

1．6 主要研究内容

1．6．1 原等跳虫成虫肠道细菌的培养与鉴定

1．6．2 原等跳虫肠道细菌的高通量测序鉴定

1．6．3 降解纤维素细菌的筛选

1．7 技术路线

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．2 主要试验仪器及试剂

2．2．1 主要试验仪器

2．2．2 主要生化试剂

2．3 实验方法

2．3．1 原等跳虫成虫肠道可培养细菌的分离与鉴定

2．3．2 肠道细菌的高通量测序

2．3．3 肠道可培养细菌中降解纤维素细菌的筛选

3 结果与分析

3．1 原等跳成虫肠道可培养细菌的初步鉴定

3．1．1 肠道可培养细菌的形态观察

3．1．2 原等跳成虫肠道可培养细菌的生理生化检测

3．2 原等跳成虫肠道可培养细菌的分子鉴定

3．2．1 肠道可培养细菌的16S rRNA基因扩增结果及分析

3．2．2 肠道细菌的16S rDNA测序结果及系统发育树

3．3 原等跳成虫肠道细菌的高通量测序结果

3．3．1 肠道细菌测序数据优化结果

3．3．2 肠道细菌有效序列稀释曲线分析

3．3．3 聚类分析及物种注释结果

3．4 降解纤维素细菌的筛选

3．4．1 肠道细菌在CMC平板上的生长结果

3．4．2 不同菌株在5种pH值p培养基下的纤维素酶活力

3．4．3 不同pH值培养基下纤维素酶活力的单因素方差分析及多重比较

4 讨论

4．1 两种方法对原等跳成虫肠道细菌鉴定结果比较

4．1．1 原等跳成虫可培养细菌的分离与鉴定

4．1．2 原等跳成虫肠道细菌高通量测序分析

4．2 不同pH值培养基对纤维素降解细菌的影响

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文