黄瓜CsCBS克隆及抗棒孢叶斑病和霜霉病功能验证

摘要

黄瓜(Cucumis sativus L.)是一种食用果实的蔬菜，因其清爽的口感深受大家喜爱。黄瓜属于草本科蔓生植物，在我国有漫长的栽培历史，是我国主要的蔬菜作物之一。露地或设施内均可种植，遍布全国各地。黄瓜棒孢叶斑病和霜霉病是黄瓜生产上的重要叶部病害，导致黄瓜产量严重下降，造成经济损失。大量使用化学药剂防治会造成环境污染，过量时导致病原菌抗药性的产生，同时农药残留还会影响人类身体健康。因此，选育及利用抗病品种则是一种绿色、经济有效的防治病害方法。 目前，黄瓜实际生产上，多抗性品种极为缺乏。本研究在前期转录组测序基础上，筛选到CBS结构域蛋白基因(Csa6M496430.1，命名CsCBS)。CBS结构域蛋白在小麦抗病中具有正向调控作用，但黄瓜中未见报道。本研究利用分子生物学手段对CsCB基因展开研究，结果如下: (1)利用qRT-PCR技术对CsCB在病原菌胁迫下的表达模式进行了分析。结果表明在单一接种霜霉病、棒孢叶斑病菌及同时接种2种病原菌的3种处理下，抗病品种D9320中接种前期CsCB表达显著上调，感病品种D0401中CsCBS表达无显著变化，说明CsCBS可积极响应霜霉病菌和棒孢叶斑病菌胁迫。 (2)采用PCR技术克隆了CsCBS序列全长。CsCBS包含一个1263 bp的开放阅读框，编码420个氨基酸。含有一个CBS结构域和一个DUF结构域，属于CBSDUF家族。 (3)对CsCB编码的氨基酸序列进行理化性质分析，CsCBS编码的蛋白分子量为103711.6，理论等电点为6.07;平均亲水系数0.107，为疏水性蛋白，无信号肽，为跨膜蛋白。 (4)对CsCBS编码的氨基酸序列进行蛋白质结构分析，CsCBS编码的蛋白中有192个α螺旋占整个肽链的45.71％;75个延伸主链占整个肽链的17.86％;31个β折叠占整个肽链的7.38％;122个无规卷曲站整个肽链的29.05％。 (5)将CsCBS与绿色荧光蛋白(GFP)进行融合，并转入拟南芥原生质体中，荧光显微镜下观察发现，CsCBS蛋白定位在细胞质中。 (6)成功构建植物过量表达载体pCXSN-CsCBS。利用农杆菌介导法将CsCBS基因转入感病品种D0401中。对转基因株系进行离体接种，结果表明过表达CsCBS后可增强黄瓜对霜霉病和棒孢叶斑病的抗性。 (7)对过表达植株进行丙二醛和可溶性糖检测，丙二醛含量降低，可溶性糖含量升高。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 国内外研究进展

1．1．1 黄瓜棒孢叶斑病

1．1．2 黄瓜霜霉病

1．2 多抗性研究

1．3 CBS结构域蛋白研究进展

1．4 研究的目的与意义

1．5 研究内容及技术路线

1．5．2 试验主要内容

1．5．3 试验技术路线

2 材料与方法

2．1 病原菌胁迫下CsCBS表达模式分析

2．1．1 试验材料

2．1．2 病原菌悬浮液配置

2．1．3 人工接种

2．1．4 取材时间

2．1．5 RNA提取

2．1．6 cDNA合成

2．1．7 引物的设计合成

2．1．8 qRT-PCR分析

2．1．9 试剂及菌株

2．2 CsCBS克隆

2．2．1 试验材料

2．2．2 试验试剂

2．2．3 CsCBS基因克隆

2．2．4 CsCBS基因PCR扩增产物回收

2．2．5 Peasy-T3载体连接及阳性筛选

2．3 CsCBS基因序列分析

2．4 CsCBS亚细胞定位

2．4．1 绿色荧光表达载体构建

2．4．2 试验材料

2．4．3 拟南芥原生质体的提取

2．4．4 高浓度质粒提取

2．4．5 35S-CsCBS-eGFP质粒转化拟南芥原生质体

2．5 黄瓜的遗传转化

2．5．1 试验材料

2．5．2 CsCBS过表达载体构建

2．5．3 过表达载体导入根癌农杆菌中

2．5．4 转基因植株鉴定

2．5．5 转基因植株人工接种鉴定

2．5．6 转基因植株表达分析

2．5．7 转基因植株生理生化指标测定

3 结果与分析

3．1 病原菌胁迫下CsCBS基因表达模式分析

3．2 CsCBS基因克隆

3．3 CsCBS基因序列分析

3．3．1 CsCBS序列分析

3．3．2 CsCBS结构分析

3．3．3 CsCBS进化分析

3．3．4 CsCBS启动子分析

3．4 CsCBS亚细胞定位

3．4．1 构建CsCBS瞬时表达载体

3．4．2 CsCBS亚细胞定位分析

3．5 黄瓜遗传转化

3．5．1 过表达载体构建

3．5．2 重组质粒导入根癌农杆菌

3．5．3 获得抗性植株

3．5．4 转基因植株鉴定

3．5．5 转基因植株基因表达分析

3．5．6 转基因植株人工接种鉴定

3．5．7 转基因植株生理生化指标测定

4 讨论

4．1 病原菌胁迫下CsCBS基因表达模式分析

4．2 CsCBS基因启动子序列分析

4．3 CBSDUF家族分析

4．4 过表达CsCBS基因可提高黄瓜抗病性

4．5 过表达植株生理生化指标

4．6 本研究的创新与不足

4．6．1 本研究的创新之处

4．6．2 本研究的不足之处

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文