内源逆转录病毒来源的endo--siRNAs对猪早期胚胎发育的影响

摘要

内源小干扰RNA(endo-siRNA)是近年来在哺乳动物生殖细胞中发现的一类新型小RNA，长度一般为20-22nt，能与AGO2蛋白结合，参与RNA干扰(RNA interference，RNAi)作用。Endo-siRNA的前体是双链RNA(dsRNA)，dsRNA在DICER的切割下产生endo-siRNA。目前研究表明，endo-siRNAs的来源包括转座子、互补转录物和长发夹结构RNA（long hairpin RNA）等。内源逆转录病毒(endogenous retrovirus，ERV)是一类重要的转座子，在人类和小鼠基因组中分别占8％和10％，其对人和小鼠胚胎早期发育起到重要的调控作用。ERV侧翼具有长末端重复序列(Long terminal repeat，LTR)结构，具有启动子和终止子的作用，其转录产物能形成dsRNA，可产生endo-siRNA。 在本实验室的前期工作中，采用小RNA高通量深度测序技术，在猪合子中鉴定了大量endo-siRNAs。在本研究中，我们主要探索LTR来源的endo-siRNAs(LTR-siRNAs)对猪早期胚胎发育的影响。我们首先通过stem loop RT-PCR对高通量测序结果进行验证，结果表明我们关注的LTR-siRNAs在猪合子中都有表达。在MⅡ期卵母细胞中注射DICER的锁核酸(LNA-iDICER)，对Dicer进行有效敲低，发现LTR-siRNAs表达量也显著下降，说明LTR-siRNAs的形成依赖于DICER。Endo-siRNAs来源于dsRNA，RNaseA处理可以降解单链RNA，但不影响dsRNA。设计LTR的荧光探针，进行RNA荧光原位杂交实验(fluorescence in situ hybridization，FISH)检测，结果在RNaseA处理组的胚胎中获得较强的荧光信号，表明LTR的转录产物可形成双链。进一步发现，通过注射LNA-iLTRs敲低合子期LTRs的表达水平，LTR-siRNAs的表达量也显著下降，说明LTR-siRNAs来源于LTRs转录产物形成的dsRNA。为了阐述LTR-siRNAs在猪胚胎早期发育过程中对靶LTRs的调控作用，我们首先通过real-time PCR检测猪早期胚胎发育各个时期LTRs和LTR-siRNAs的表达模式，结果表明在猪早期胚胎发育各时期LTR-siRNAs对LTRs的表达具有抑制作用。这一现象进一步通过在MⅡ期卵母细胞中注射LTR-siRNAs的模拟物(mimics)和阻抑物(inhibitors)得到验证。最后，我们通过在MⅡ期卵母细胞中注射LTR-siRNAs的mimics和inhibitors以及LTR锁核酸(LNA-iLTRs)，检测LTR-siRNAs及其靶LTRs对猪早期胚胎发育的影响。结果显示，与对照组相比，LTR-siRNAs mimics和inhibitors及LNA-iLTRs注射组卵裂率、囊胚率都显著下降，表明LTR-siRNAs通过调控靶LTRs的表达水平对猪胚胎早期发育具有显著的调控作用。

目录

声明

摘要

1 引言

1．2 Endo-siRNA的特点

1．3 Endo-siRNA的生物发生过程

1．4 Endo-siRNA的来源

1．4．2 Endo-siRNA来源于顺式天然反义转录

1．4．4 Endo-siRNA来自于长发夹结构的RNA

1．6 Endo-siRNA与早期胚胎发育

1．7 本研究目的与意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验材料

2．1．2 主要仪器和设备

2．1．3 主要试剂和试剂盒

2．1．4 引物设计

2．1．5 主要试剂的配制

2．1．6 主要生物学分析软件

2．2 实验方法

2．2．3 卵母细胞的去除和成熟卵母细胞的分选

2．2．4 持卵针、注射针的制备

2．2．5 卵母细胞显微注射

2．2．6 注射后卵母细胞孤雌激活(PA)

2．2．8 胚胎总RNA的提取

2．2．9 RNA反转成cDNA

2．2．10 琼脂糖凝胶电泳

2．2．11 胚胎小RNA的提取

2．2．12 小RNA反转录

2．2．13 实时定量PCR

2．2．14 Western blot

2．2．15 RNA FISH

2．2．16 数据分析

3 结果与分析

3．1 猪合子小RNA测序及鉴定

3．1．1 猪合子小RNA的测序

3．1．2 猪合子小RNA的鉴定

3．2 LTR-siRNA的形成机制研究

3．2．1 LTR-siRNAs的形成依赖Dicer

3．2．2 LTR-siRNAs的形成依赖双链RNA(dsRNA)

3．2．3 LTR-siRNAs的形成依赖LTR的转录

3．3 LTR-siRNA对LTR表达的调控

3．3．1 检测LTRs、LTR-siRNAs在猪早期胚胎发育各时期的表达模式

3．3．2 LTR-siRNAs对LTRs表达的调控

3．4 LTR-siRNA对猪早期胚胎发育的影响

4 讨论

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文