番茄CIPK基因的进化与非生物胁迫响应分析

摘要

番茄（Solanum lycopersicum）作为一种世界性蔬菜在全球广受欢迎，但由于逆境造成的减产现象时有发生，低温、干旱、高盐作为主要的非生物胁迫，对番茄植株的生长发育影响十分严重。当植物遭受非生物胁迫后会引起细胞质中钙离子浓度短暂的急迅升高，起始植株对非生物胁迫的钙信号系统。CIPK蛋白家族作为钙离子介导的植物信号转导通路上的重要蛋白家族，自1998年在拟南芥中发现后就备受关注，在植物逆境应答和生长发育中发挥着不可忽视的作用，但番茄CIPK基因家族及其在非生物胁迫响应中作用的研究还未见报道。 主要研究结果如下: (1)本研究通过生物信息学方法成功鉴定出22个番茄CIPK基因家族成员，按照内含子个数的多少分为内含子富集和内含子缺失两类。构建系统进化树，可将CIPK基因家族分为八个亚家族并且番茄CIPK在各亚族中均有分布。SlCIPKs上游1500bp序列中存在多个在不同逆境中起作用的顺式作用元件，并预测了SlCIPKs与SlCBLs的相互作用。通过蛋白之间的相互作用预测发现，一个番茄CBL可与一个或者多个番茄CIPK相互作用，同样，一个番茄CIPK也可与一个或多个番茄CBL相互作用。通过分析低温(4℃)下0h、1h、12h番茄转录组数据发现SlCIPKs表达量均有不同程度的变化。 (2)利用qRT-PCR技术检测非生物胁迫（低温、高盐、干旱处理）下番茄CIPK基因家族各成员的表达量。结果表明，番茄CIPK对各非生物胁迫均有不同程度的响应，其中SlCIPK1、SlCIPK8变化较明显，qRT-PCR结果显示SlCIPK1在冷胁迫初期表达量明显上升，SlCIPK8在不同时间点的三种处理下表达量均显著提高，表明SlCIPK1、SlCIPK8可能参与不同非生物胁迫的应答。 (3)利用VIGS技术对番茄幼苗中SlCIPK1、SlCIPK8分别进行沉默后进行沉默植株与对照植株在低温、干旱、高盐胁迫下的处理并进行抗坏血酸过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化物酶、脯氨酸、过氧化氢酶、丙二醛含量的测定，结果显示冷胁迫后期SlCIPK1、SlCIPK8沉默的植株与正常植株相比抗冷性显著降低，SlCIPK1、SlCIPK8沉默植物抗干旱能力较差，证明SlCIPK1、SlCIPK8可能与低温、干旱的抗性反应应答相关。 (4)为了进一步研究SlCIPK1、SlCIPK8所介导的低温信号途径，本试验成功构建并鉴定了一个较高质量的低温番茄酵母cDNA文库，并成功构建了两个诱饵载体:pGBKT7-SlCIPK1、pGBKT7-SlCIPK8，用于筛选低温下与SlCIPK1、SlCIPK8互作的蛋白。 本研究首次预测了番茄CIPK基因家族成员的序列信息并系统地研究了番茄CIPK基因家族成员在非生物胁迫下的变化，对其非生物胁迫下的响应以及信号转导途径有了一定的了解。为培育抗非生物胁迫的番茄品种提供候选效应基因材料。

目录

声明

摘要

1．引言

1．1 研究的目的与意义

1．2 文献综述

1．2．1 植物中的钙离子

1．2．2 VIGS

1．2．3 酵母双杂交

1．3 本研究的内容和技术路线

1．3．1 研究的内容

1．3．2 技术路线

2．材料和方法

2．1 番茄CIPK基因家族的生物信息学分析

2．1．1 番茄CIPK基因家族的鉴定及理化性质分析

2．1．2 番茄CIPK基因家族系统进化分析

2．1．3 番茄ClPK基因结构分析

2．1．6 番茄低温转录组数据中番茄CIPK表达量分析

2．2 番茄CIPK基因家族非生物胁迫下表达特征分析

2．2．1 试验材料

2．2．2 试验方法

2．3 番茄SlCIPK1、SlCIPK8沉默在番茄非生物胁迫中的功能分析

2．3．1 试验材料

2．3．2 试验方法

2．4 低温番茄酵母cDNA文库的构建

2．4．1 试验材料

2．4．2 试验方法

2．5 诱饵蛋白PGBKT7-SlCIPK1、PGBKT7-SlCIPK8的构建

2．5．1 试验材料

2．5．2 试验方法

3．结果与分析

3．1 番茄CIPK基因家族生物信息学分析

3．1．1 番茄CIPK基因家族的鉴定及理化性质分析

3．1．2 番茄CIPK基因系统进化分析

3．1．3 番茄CIPK基因结构分析

3．1．4 番茄CIPK基因家族顺式作用原件分析

3．1．5 番茄CBL、CIPK相互作用分析

3．1．6 番茄低温转录组数据中CIPK表达量分析

3．2 非生物胁迫下番茄CIPK基因家族表达分析

3．2．1 番茄CIPK基因响应低温胁迫诱导

3．2．2 番茄CIPK基因响应干旱胁迫诱导

3．2．3 番茄CIPK基因响应高盐胁迫诱导

3．3 番茄SlCIPK1、SlCIPK8沉默在番茄非生物胁迫中的功能分析

3．3．1 SlCIPK1、SlCIPK8片段的克隆

3．3．4 病毒诱导SlCIPK1、SlCIPK8沉默植株的症状观察

3．3．5 病毒诱导SlCIPK1、SlCIPK8沉默效率评价

3．3．6 SlCIPK1、SlCIPK8沉默植株的非生物胁迫抗性鉴定

3．4 低温番茄酵母双杂交文库的构建

3．4．1 mRNA的分离纯化

3．4．2 初级文库的构建及质量鉴定

3．4．3 酵母双杂交cDNA文库的构建及质量鉴定

3．4．4 转化酵母试验结果

3．5 诱饵蛋白pGBKT7-SlCIPK1、pGBKT7-SlCIPK8的构建

3．5．1 SlCIPK1、SlCIPK8全长的克隆

3．5．2 pBGKT7-SlCIPK1、pGBKT7-SlCIPK8的构建

4．讨论

4．1 番茄CIPK基因家族生物信息学分析

4．2 非生物胁迫下番茄CIPK基因家族表达分析

4．3 番茄SlCIPK1、SlCIPK8沉默在番茄非生物胁迫中的功能分析

4．4 番茄低温cDNA酵母文库的构建

4．5 工作展望

5．结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文