MsRCI2A、MsRCI2B、MsRCI2C基因超量表达对苜蓿耐碱性的影响

摘要

紫花苜蓿是中国重要的多年生的豆科植物，其具有高产、营养成分多样化及抗逆性强的特点，但恶化的土地条件仍限制了苜蓿的产量。多个研究表明RCI2/PMP3类基因作为多基因家族普遍存在于植物中，可响应多种非生物胁迫，包括低温、干旱、盐，且被激素诱导。且多个研究表明RCI2/PMP3基因在植物中的超量表达可通过提高膜的稳定性及保持细胞内的离子平衡来增加抗多种非生物胁迫的耐力。关于RCI2类基因在苜蓿中的超量表达是否可以提高苜蓿抗非生物胁迫的能力仍是未知的。本研究从紫花苜蓿中克隆了MsRCI2A，MsRCI2B和MsRCI2C基因，构建了三个植物表达载体以连接目的基因。通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法转化紫花苜蓿子叶节，并通过分子生物学技术对所筛选的抗性植株进行检测。分析了MsRCI2A、MsRCI2B、MsRCI2C基因超量表达对苜蓿耐碱性的影响，为培育出耐逆性转基因苜蓿提供重要的理论依据以及为促进畜牧业的蓬勃发展奠定基础。
　　本研究的主要研究结果如下:
　　1.在紫花苜蓿中克隆了RCI2类基因家族成员MsRCI2A、MsRCI2B、MsRCI2C基因，蛋白质分子质量分别为5.931-kDa、5.946-kDa、6.05-kDa，它们的序列高度同源，都对碱、干旱、低温胁迫和ABA诱导产生响应，但它们对每种胁迫响应程度不同，并且在根和叶中具有不同的表达模式。本研究构建了三个连接目的基因植物表达载体，采用农杆菌介导的遗传转化方法转化紫花苜蓿的子叶节。每个基因分别获得了两株超量表达的植株。
　　2.对转基因株系及野生型株系扦插扩繁，对各株系进行100mM NaHCO3（pH调至8.5）处理。经碱处理15d后，超量表达MsRCI2A、MsRCI2B、MsRCI2C基因的各株系仍能保持良好的生长状态，而WT株系的生长受到了明显的抑制，叶片变得枯黄且萎蔫。并且碱处理后超量表达MsRCI2A、MsRCI2B、MsRCI2C基因的各株系相对于非转基因株系有更高的叶绿素含量，积累了更高水平的可溶性糖含量且抗氧化物酶SOD、POD及CAT的活性更高，而丙二醛的含量及相对电导率更低。在未处理和碱胁迫处理5d、10d时，超量表达MsRCI2A，MsRCI2B和MsRCI2C基因的各株系比非转基因株系积累了更多的脯氨酸，但碱胁迫处理15d时，由于非转基因株系受损伤的程度更为严重，以至于积累更多的脯氨酸响应胁迫。
　　3.分析了碱处理后各转基因株系中的碱胁迫相关基因H+-ATPase及与所转基因相同源的RCI2类基因的表达情况。相对于对照条件下，碱胁迫处理12h后，H+-ATPase在WT及超量表达MsRCI2B基因株系B13与B19中的表达削弱，在超量表达MsRCI2A基因株系A12、A22中略有上调，而在超量表达MsRCI2C基因的株系C2、C10中的表达呈显著上调趋势。有趣的是，碱胁迫处理12h时，MsRCI2A、MsRCI2B、MsRCI2C基因在野生型株系中的表达呈上调趋势，MsRCI2A、MsRCI2B基因在超量表达MsRCI2C基因株系C2与C10中呈上调表达趋势，其中MsRCI2A基因上调的程度较野生型大，而MsRCI2B、MsRCI2C基因在超量表达MsRCI2A基因株系A12、A22中的表达受到了抑制，MsRCI2A、MsRCI2C基因在超量表达MsRCI2B基因株系B13、B19中的表达受到了抑制。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 研究目的与意义

1．2 紫花苜蓿概况

1．3 紫花苜蓿的抗逆性研究

1．3．1 紫花苜蓿的抗盐碱性

1．3．2 紫花苜蓿的抗旱性

1．3．3 紫花苜蓿的抗低温性

1．4 RCI2类基因的研究进展

1．4．2 参与低温胁迫

1．4．3 参与盐碱胁迫和渗透胁迫

1．4．4 参与干旱胁迫、高温胁迫

1．5 本研究的主要内容

1．5．1 研究内容

1．5．2 技术路线

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．4 常用酶类及试剂

2．1．5 培养基

2．3 MsRCI2A、MsRCI2B、MsRCI2C基因在非生物胁迫下的表达

2．3．1 非生物胁迫处理紫花苜蓿

2．3．2 提取紫花苜蓿总RNA

2．3．3 cDNA的合成

2．3．4 实时荧光定量qPCR

2．4 MsRCI2A、MsRCI2B、MsRCI2C基因的克隆及序列分析

2．4．1 MsRCI2A、MsRCI2B、MsRCI2C的基因克隆

2．4．2 RCI2类基因家族的分析

2．5．2 目的基因与线性载体胶回收纯化

2．5．3 目的基因与线性载体连接

2．5．4 大肠杆菌的转化

2．5．5 质粒提取

2．5．6 PCR验证

2．5．7 农杆菌转化

2．6 转基因苜蓿的遗传转化过程

2．6．1 草铵膦筛选压力的确定

2．6．2 转基因植株的再生过程

2．7 抗性植株的检测及扦插扩繁

2．7．1 植物基因组DNA提取及PCR检测

2．7．2 植物基因组RNA提取及RT-PCR检测

2．7．3 qRT-PCR检测

2．7．4 转基因株系与对照株系的扦插扩繁

2．8 碱胁迫下转基因苜蓿和非转基因苜蓿的生理与生化指标测定

2．8．1 碱胁迫处理及待测样品的取材

2．8．2 叶绿素含量的测定

2．8．3 电导率的测定

2．9 数据整理与分析

3 结果与分析

3．2．2 RCI2类基因在低温胁迫下的表达分析

3．2．3 RCI2类基因在干旱胁迫下的表达分析

3．3 MsRCI2A、MsRCI2B、MsRCI2C基因的克隆及序列分析

3．3．1 MsRCI2A、MsRCI2B、MsRCI2C基因的克隆结果

3．3．2 序列分析

3．4 MsRCI2A、MsRCI2B、MsRCI2C基因表达载体的构建

3．5 植物表达载体导入农杆菌

3．6 草铵膦筛选压力的确定

3．7 抗性植株的分子生物学检测

3．7．2 转MsRCI2B基因抗性株系的分子生物学检测

3．7．3 转MsRCI2C基因抗性株系的分子生物学检测

3．8 转基因紫花苜蓿株系的表型分析

3．8．3 超量表达MsRCI2C基因苜蓿的表型分析

3．9 碱胁迫下转基因紫花苜蓿生理指标及相关基因的分析

3．9．1 碱胁迫下转基因紫花苜蓿叶绿素含量的变化

3．9．2 碱胁迫下转基因紫花苜蓿相对电导率的变化

3．9．3 碱胁迫下转基因紫花苜蓿中脯氨酸含量的变化

3．9．4 碱胁迫下转基因紫花苜蓿中可溶性糖含量的变化

3．9．5 碱胁迫下转基因紫花苜蓿丙二醛含量的变化

3．9．6 碱胁迫下转基因紫花苜蓿中SOD酶活的变化

3．9．7 碱胁迫下转基因紫花苜蓿中POD酶活的变化

3．9．8 碱胁迫下转基因紫花苜蓿中CAT酶活的变化

3．9．9 碱胁迫下转基因苜蓿中的胁迫响应基因的表达变化

4 讨论

4．1 目的基因的选择

4．2 MsRCI2A、MsRCI2B、MsRCI2C基因对非生物胁迫的应答

4．3 转基因植株的耐碱生理机制和相关基因的表达

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文