CsPAP--fib基因在低温诱导黄瓜雌性分化中功能解析

摘要

黄瓜被认为是研究性别分化的模式植物，目前对于黄瓜性别分化的问题研究主要从遗传因素、环境因素和植物激素三方面入手，本实验室前期对温敏型黄瓜品种‘C09-123’在不同低夜温条件下的蛋白差异进行分析，发现一个在12℃低夜温下上调表达的蛋白，推测该蛋白参与了低夜温诱导的黄瓜雌性分化。因此，本研究基于前期工作基础，主要利用分子生物学技术，探究低夜温促进黄瓜雌性分化的分子机制，为黄瓜雌性系新品种选育提供理论依据。本文获得的研究结果如下: 1、对前期试验发现的差异蛋白基因进行克隆分析，认定其属于PAP-fibrillin蛋白家族，将编码该蛋白的基因命名为CsPAP-fib。CsPAP-fib全长为870 bp，编码289个氨基酸，其蛋白理论分子量31.15 kDa，理论等电点为6.34，原子组成为C1393H2256N378O424S2;蛋白序列同源性比对，黄瓜和甜瓜构成一个小的进化分支，同源关系很近，二者与伞形科的胡萝卜（Daucus carota L.）同源性相对较高。 2、不同夜温处理下CsPAP-fib组织特异性表达分析结果表明，在低夜温(12℃)条件下，CsPAP-fib在黄瓜叶片中的表达量最高，且显著高于根、茎、茎尖;在高夜温(24℃)和正常夜温(18℃)条件下，CsPAP-fib在根、茎、叶及茎尖等器官中的表达量差异不显著。表明CsPAP-fib响应低夜温，在叶片中特异性表达，发挥作用。 3、不同夜温处理下CsPAP-fib时空表达分析结果显示，在黄瓜幼苗从“两叶一心”发育到“四叶一心”时期，在受到12℃低夜温胁迫时，CsPAP-fib在叶中的表达量显著降低，根、茎以及茎尖的表达量无显著变化;在18℃正常夜温下，“四叶一心”时期的根和叶中的相对表达量显著增高，分别为“两叶一心”时期的4.63倍和2.53倍，茎和茎尖中的相对表达量无显著变化;在24℃高夜温条件下，“四叶一心”期根中的相对表达量显著增高，为“两叶一心”时期的4.09倍，其他部位的相对表达量差异不显著。 4、将CsPAP-fib与绿色荧光蛋白(GFP)载体进行融合，并转入拟南芥原生质体中，激光共聚焦显微镜下观察发现，CsPAP-fib蛋白定位在叶绿体上。 5、构建植物表达载体PCXSN1250-CsPAP-fib，利用农杆菌介导法将正义与反义CsPAP-fib基因转入黄瓜，得到T0代转基因植株。 6、在12℃低夜温条件下，过量表达CsPAP-fib可显著提高黄瓜植株雌花节率，并降低第一雌花节位。 7、在12℃低夜温条件下，过量表达CsPAP-fib植株的乙烯释放量显著提高，而转反义CsPAP-fib植株的乙烯释放量与对照组相比变化不显著。转正义CsPAP-fib植株的赤霉素含量与对照相比变化不显著，而转反义表达CsPAP-fib可显著减少黄瓜植株的赤霉素含量。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 研究的目的与意义

1．2 国内外研究进展

1．2．1 黄瓜的性别表现型

1．2．2 黄瓜的性别决定基因

1．2．3 低夜温促进雌性分化

1．2．4 乙烯对黄瓜性别分化的影响

1．2．5 赤霉素对黄瓜性别分化的影响

1．2．6 Fibrillin家族的研究

1．3 研究内容及技术路线

1．3．1 试验主要内容

1．3．2 试验技术路线

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．2 CsPAP-fib的克隆

2．2．1 黄瓜叶片RNA的提取与检测

2．2．2 cDNA第1链的合成

2．2．3 CsPAP-fib的克隆

2．2．4 CsPAP-fib PCR扩增产物的回收

2．2．5 CsPAP-fib连接pEASY-T3载体与阳性克隆筛选

2．3 CsPAP-fib的生物信息学分析

2．4 CsPAP-fib表达模式分析

2．5 CsPAP-fib亚细胞定位分析

2．5．1 植物绿色荧光表达载体的构建

2．5．2 质粒的纯化浓缩

2．5．3 拟南芥原生质体细胞的制备

2．5．4 CsPAP-fib-GFP质粒转化拟南芥原生质

2．6 CsPAP-fib对黄瓜的遗传转化

2．6．1 试验材料与培养基

2．6．2 遗传转化载体的构建

2．6．3 黄瓜遗传转化实验方法

2．7 转基因阳性植株功能验证

2．7．1 乙烯含量的测定

2．7．2 赤霉素含量的测定

3 结果与分析

3．1 CsPAP-fib的克隆

3．1．1 黄瓜植株总RNA的检测

3．1．2 CsPAP-fib的全长及酶切验证

3．2 生物信息学分析

3．2．1 蛋白质理化性质分析

3．2．2 蛋白质信号肽预测

3．2．3 CsPAP-fib蛋白跨膜区域预测

3．2．5 CsPAP-fib蛋白的高级结构预测

3．2．6 CsPAP-fib蛋白系统进化分析

3．3 基因表达模式分析

3．3．2 不同夜温处理下CsPAP-fib在两个发育时期的表达分析

3．4 CsPAP-fib亚细胞定位

3．4．1 植物绿色荧光表达载体的构建

3．4．2 CsPAP-fib在拟南芥原生质体的定位

3．5 CsPAP-fib植物表达载体构建

3．6 黄瓜遗传转化

3．6．1 草甘膦抗性筛选

3．6．2 CsPAP-fib转基因黄瓜植株的获得

3．7 转基因黄瓜抗性植株的分子鉴定

3．7．1 转基因黄瓜的PCR鉴定

3．7．2 转基因黄瓜植株的荧光定量PCR鉴定

3．8 转基因植株功能验证

3．8．1 转基因植株第一雌花节位表现

3．8．2 转基因植株雌花节率表现

3．8．3 转CsPAP-fib植株的乙烯含量测定分析

3．8．4 转CsPAP-fib植株的赤霉素含量测定分析

4 讨论

4．3 CsPAP-fib的表达模式

4．4 原纤蛋白的亚细胞定位多样性

4．5 CsPAP-fib响应低夜温促进雌花分化

4．6 展望

4．7 本研究的创新与不足

4．7．1 本研究的创新之处

4．7．2 本研究的不足之处

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文