蚂蚁共生放线菌Streptomyces capitiformicae的鉴定及全基因组测序分析

摘要

近年来新型抗生素发展缓慢，人们逐渐发现昆虫共生菌，能够产生大量有活性的次级代谢产物，特别是针对病原菌能够表现出明显拮抗活性的菌株，从此类菌株分离得到抗生素的概率要远大于无拮抗活性的菌株。同样现代分类学意义上的新菌，也是新型抗生素与高效抗菌素的主要来源。从昆虫共生菌所分离得到的化合物，总体来说是对昆虫自身无毒害作用的，所以理论上此类型的抗生素所产生的毒副作用相较于其它分离源的菌株更加温和，故此类抗生素可以较为安全的投入到动植物上使用。也正是因为昆虫共生放线菌产生的化合物具有毒副作用弱、活性效果好、抗生素结构新颖，不易产生耐受等优点，相关研究逐渐受到科研工作者的重视。昆虫也因其种类繁多而变为新型抗生素发掘的重要来源，对于治疗和防御如今已产生耐药性的病原菌以及新型疾病的日益增多具有重大意义。 本研究第一步先是以实验室分离的一株蚂蚁头部共生菌株1H-SSA4为供试菌株，对该菌株的16S rRNA进行测序，通过Ezbiocloud数据库比对分析可知，该菌株1H-SSA4可能为链霉菌属的一个新种，采取多相分类学方法进行新种分类学鉴定;通过培养特征比较、形态特征观察、生理生化指标对比、化学成分对比等多方面分别进行鉴定，最终确定该菌株1H-SSA4为链霉菌属的一个新种。第二步是通过对1H-SSA4的次级代谢产物的主产物进行分离，共分离得到3个已知Angucyclinone类抗生素同系物，而后对1H-S SA4进行全基因组分析，验证了Angucyclinone类抗生素生物合成基因簇的存在，并分析了生物合成基因簇的组成，同时标注了1H-SSA4还可能产生的其余三类化合物组成。 实验结果如下: (1)通过对菌株16S rRNA的测序对比，结果显示菌株1H-SSA4可能是一株新的链霉菌，与第一相似Streptomyces hygroscopicus subsp.ossamyceticus NBRC13983T的相似性为98.9％，1H-SSA4与第一相似菌和其它三株相似菌Streptomyces torulosus LMG20305T(98.8％),Streptomyces ipomoeae NBRC13050T(98.5％),Streptomyces decoyicus NRRL2666T(98.4％)在三种系统进化树中均能形成稳定分支。通过对菌株1H-SSA4的形态特征观察发现其与相似菌株存在明显差别，且孢子链形态呈螺旋状完全符合链霉菌属特征，生理生化结果与相似菌存在明显的不同，化学分类学特征（全细胞水解糖、磷酸类脂、甲基萘醌、脂肪酸）等成分含量及比例均符合链霉菌属的特征。而DNA同源性结果显示均＜70％，表明菌株1H-SSA4在基因组成上与四株相似菌存在不同，因此确定菌株1H-SSA4是链霉菌属的一个新种，命名为Streptomyces capitiformicae，典型菌株是1H-SSA4T(=DSM140537T=CGMCC4.7403T)。 (2)通过对菌株1H-SSA4T进行扩大发酵培养，对发酵产物根据不同的分离原理进行分离，利用现代光谱学等手段，进行化合物相对构型的分析与鉴定，得到三个化合物1H01、1H02和1H03，并根据现代光谱学技术初步确定了三个化合物的相对构型。查阅了相关文献，基本确定了化合物1H01和化合物1H02为Angucyclinone类抗生素8-O-methyltetrangulol和8-O-methyltetrangomycin，化合物1H03为Angucyclinone类抗生素Fugianmycin B，三种化合物均符合醌酮类化合物构型。通过全基因组测序技术验证了1H-SSA4T可以生产Angucyclinone类抗生素的基因簇的存在，对剩余基因簇分析预测出1HSSA4T可能产生其它类型化合物的核心结构。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 昆虫共生菌研究进展

1．1．1 昆虫共生微生物简介

1．1．2 昆虫共生菌与宿主的关系及作用

1．1．3 昆虫共生微生物次级代谢产物中醌酮类化合物研究进展

1．2 链霉菌新种多相分类学鉴定方法研究进展

1．3 日本弓背蚁及相关菌群的研究进展

1．3．1 日本弓背蚁简介

1．3．2 日本弓背蚁(Camponotusjaponicus Mary)相关菌群的研究进展

1．4 全基因组测序技术研究进展及其概述

1．5 研究目的及意义

2 材料与方法

2．1 菌株来源

2．2 试剂与仪器

2．2．1 试剂

2．2．2 仪器

2．3 主要培养基和试剂的配制方法

2．4 新种的多相分类学鉴定

2．4．1 形态和培养特征鉴定

2．4．2 生理生化特性鉴定

2．4．3 化学分类学鉴定

2．4．4 分子水平鉴定

2．5 昆虫共生菌的次级代谢产物分离

2．5．1 发酵培养基的筛选和处理

2．5．2 次级代谢产物分离步骤

2．6 全基因组数据分析方法

2．6．1 原始数据处理方法

2．6．2 次级代谢产物在线分析方法

2．6．3 蛋白直系同源簇(COG)注释方法

3 结果与分析

3．1．2 形态及培养特征

3．1．3 生理生化特性

3．1．4 化学分类学鉴定结果分析

3．1．5 DNA同源性分析

3．2 次级代谢产物分离

3．2．1 发酵培养基筛选

3．2．2 主产化合物分离

3．3 全基因组测序分析

3．3．1 全基因组序列概述

3．3．2 次级代谢产物合成基因簇分析结果

3．3．3 蛋白直系同源簇(COG)数据分析结果

4 讨论

4．1 昆虫内生放线菌的多样性及活性研究

4．2 Angucyclinone类抗生素研究

4．3 昆虫共生放线菌的科研潜力

5 结论

5．1 主要结论

5．2 本研究的主要创新

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文