右美托咪定通过调控NF--κB/AP--1--iNOS/NO对大鼠SAKI的保护作用研究

摘要

脓毒血症致急性肾损伤（Septic acute kidney injury,SAKI）是兽医临床高发病率和致死率的全身性感染并发症。探寻有效防治药物及阐明关键药效机制是该领域的研究焦点，以往对SAKI的病理生理学机制研究多集中在炎症反应方面，近年来研究的关注点开始向氧化应激损伤方面转移。课题组前期研究发现右美托咪定(Dexmedetomidine，DEX)能够通过减轻氧化应激损伤，发挥对犬SAKI的保护作用。因此本试验选用SD大鼠，建立SAKI模型，应用DEX进行干预，从抑制氧化应激因子生成角度，探讨DEX对NF-κB/AP-1—iNOS/NO的调控机制，并以此为基础，通过调控α2肾上腺素受体(α2-AR)及咪唑啉受体(I2R)，探寻DEX的药效靶位，进一步完善其药理作用分子机制，为今后临床开展SAKI的治疗及进行相关的机制研究提供理论依据及试验基础。 本试验选取42只健康SD大鼠，随机分成7组，分别为C组、L组、W组、D组、A组、I组、Z组。C组注射等体积生理盐水，其余各组腹腔注射10 mg/kg LPS，其中W组与D、A、I、Z四组分别提前30 min腹腔注射15 mg/kg1400 W和30μg/kg DEX，在DEX注射前30 min，分别给A组腹腔注射250μg/kg阿替美唑(Atipamezole，ATI)，I组腹腔注射1.5mg/kg咪唑克生(Idazoxan，IDA)，Z组腹腔注射250μg/kg ATI及1.5 mg/kg IDA。造模4h后心脏采血并处死大鼠，取肾脏备用。通过大鼠肾功能检测，肾脏病理组织学观察，氧化应激相关指标检测，诱导型一氧化氮合酶(Induced nitric oxide synthase，iNOS)活力及NO含量测定，DEX可能的保护机制中相关分子标志物mRNA及蛋白表达量变化等一系列检测，探讨DEX对大鼠SAKI的保护作用机制及药效靶位。试验结果如下: 肾功能指标检测结果表明，各组间相比，L组尿素氮(BUN)含量最高，A、I两组BUN含量次之，与L组相比差异极显著(p＜0.01)，W、D组的BUN水平较I组有所上升，差异极显著(p＜0.01)，C组尿素氮含量最低，与I组比较差异极显著(p＜0.01);各组间相比，L、A、Z组的血肌酐(SCr)水平明显升高，与W组、D组、I组比差异极显著(p＜0.01)，C组血肌酐水平最低;统计BUN/SCr发现，L、A、Z三组BUN/SCr比值明显大于W组、D组、I组(p＜0.01)，其中W组BUN/SCr比值显著高于D、I两组(p＜0.05)，C组BUN/SCr最低，且比值在12∶1-20∶1正常范围内;L、A、Z三组中的尿中肾损伤分子1(Kidney injurymolecule1，KIM-1)含量最高，与W、D、I各组相比差异极显著(p＜0.01)，C组尿KIM-1含量最低。HE染色发现，C组的大鼠肾组织结构正常，肾小管、肾间质未见明显的病理性改变;L、A、Z组肾小管上皮细胞肿胀，坏死，部分出现空泡样变性，细胞核消失，肾间质出现炎性细胞浸润，管腔内有伊红色蛋白样物质沉积，W、D、I三组肾损伤情况明显改善，肾小管上皮细胞肿胀程度有所减轻，偶见空泡样变性，肾间质炎症细胞浸润减少。氧化应激因子检测结果如下，各组间相比，L、A、Z三组活性氮(Reactive nitrogen species，RNS)含量高于其他各组，且差异极显著(p＜0.01)，C组RNS水平较D组、I组显著下降(p＜0.05)，具有统计学意义，W组RNS含量最低;L组、Z组、A组的丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量显著上调(p＜0.01)，D组、I组的MDA水平与W组相比明显减少(p＜0.01)，C组MDA含量最低，与其他组相比差异极显著(p＜0.01);D、I两组的超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，SOD)活力明显升高，且差异极显著(p＜0.01)，W、A、Z三组SOD活性与C、L两组相比显著增强(p＜0.01);D组谷胱甘肽(glutathione，GSH)浓度最高，C组、I组与D组相比GSH含量显著下调(p＜0.01)，W组GSH水平远高于L、A、Z三组(p＜0.01)，其中L组GSH水平最低，且差异极显著(p＜0.01)。ELISA测定iNOS活力及NO水平可知，L、A、Z三组的iNOS活力极显著增强(p＜0.01);过量NO是机体微循环障碍，氧化应激损伤的诱因之一。各组间比较，L、A、Z组NO含量较其他组明显增多，且差异极显著(p＜0.01)，W、D、I三组NO水平下调，但仍显著高于C组(p＜0.05)。实时荧光定量(Real-time PCR)试验显示L、W、A、Z四组c-Jun mRNA、c-Fos mRNA、NF-κB mRNA、iNOS mRNA表达量明显上调，与其他组相比差异极显著(p＜0.01)，C组表达量最少。蛋白印迹法(WesternB lot)测定相关分子标志物蛋白表达量显示，各组间比较，L、W、A、Z四组c-Jun、 c-Fos、p-IκB/IκB及胞浆胞核中p-NF-κB蛋白表达量较其他各组明显升高，C、D、A三组p-IκB/IκB及胞浆胞核中p-NF-κB蛋白表达量无显著性差异，I组c-Jun蛋白表达量最低(p＜0.01)，C组c-Fos蛋白表达量最低(p＜0.01)。 综合本试验结果提示，大鼠体内大量累积的NO可刺激机体产生RNS，导致氧化应激损伤，在LPS诱发的大鼠SAKI中扮演重要角色。DEX能够通过减轻机体氧化应激损伤逆转LPS诱导的大鼠SAKI。DEX可下调NF-κB/AP-1的mRNA及蛋白表达量，抑制iNOS活力，减少NO释放，降低大鼠脓毒血症时的氧化应激因子水平，氧化应激损伤得以改善，由脓毒血症诱发的大鼠AKI明显减轻。

目录

声明

摘要

1 前言

1．2．1 血流动力学对SAKI的影响

1．2．2 炎症对SAKI的影响

1．2．3 免疫抑制及细胞凋亡对SAKI影响

1．2．4 氧化应激及微循环障碍对SAKI的影响

1．3 右美托眯定对SAKI的保护作用

1．3．1 DEX在血流动力学方面的作用

1．3．2 DEX在炎症方面的作用

1．3．3 DEX在氧化应激中的作用

1．3．4 DEX在细胞凋亡中的作用

1．4 研究目的与意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 试验动物

2．1．2 主要仪器设备

2．1．3 试验主要试剂和药品

2．2 试验方法

2．2．1 试验分组及模型建立

2．2．2 试验动物标本留取

2．2．3 大鼠肾脏组织HE染色

2．2．4 大鼠肾功能检测

2．2．5 大鼠肾组织氧化应激指标检测

2．2．6 肾脏组织中iNOS活力检测

2．2．7 肾脏组织中NO含量检测

2．2．8 Real-time PCR检测c-Jun、c-Fos、NF-κB、iNOS的表达

2．2．9 Western Blot检测c-Jun、c-Fos、p-IκB／IκB、胞浆胞核p-NF-κB蛋白表达量

2．3 数据处理

3 结果

3．2 肾脏病理学变化结果

3．3 大鼠肾组织氧化应激指标变化

3．4 肾脏组织iNOS活力变化

3．5 肾脏组织NO含量变化

3．6 肾组织c-Jun、c-Fos、NF-κB、iNOS mRNA表达结果

3．7 肾组织c-Jun、c-Fos、p-IκB／IκB、胞浆胞核p-NF-κB蛋白表达量

4 讨论

4．1 DEX干预对肾功能及组织病理学的影响

4．2 DEX干预对氧化应激因子的影响

4．3 DEX对iNOS／NO的调控作用

4．4 DEX对NF-κB／AP-1及相关分子标志物表达的影响

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文