化脓隐秘杆菌溶血素Domain 4单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的建立

摘要

化脓隐秘杆菌（Trueperella pyogenes，T.pyogenes）是一种革兰氏阳性、不规则、无运动性及不含孢子结构的短杆菌。它被认为是一种广泛存在于家畜黏膜表面的较为常见的机会性致病菌，可引起宿主发生多种器官化脓性感染。溶血素(Pyolysin，PLO)是T.pyogenes主要的毒力因子之一，其作为一种外毒素，具有溶解细胞的生物学特性。与其他胆固醇依赖性溶细胞家族(Family of cholesterol-dependent cytolysin，CDCs)相同，PLO蛋白分子具有四个结构域，其第四结构域(Domain4，D4)的作用是识别并结合细胞膜上的胆固醇。
　　本研究制备出了5株针对PLO D4的mAbs(monoclonal antibody,mAb)，其中4株(2G3、3C8、3G10、4C9)具有较强的抗溶血活性，而3C7的抗溶血活性较低。通过Western-blot法进行表位区筛选，结果表明3C7所针对的表位区位于PLO前体（含27个氨基酸信号肽）的第519-534位氨基酸(amino acid，AA)（以下简称PLO519-534AA），而具有较强抗溶血活性的4株mAbs所针对的表位区位于PLO前体第487-502位氨基酸(以下简称PLO487-502AA)处，这段表位区包含了完整的十一肽基序(PLO491-501AA)，证实了十一肽基序对PLO溶血活性有着重要的影响。
　　上述5株mAbs均可以与由T.pyogenes培养物粗纯化获得的天然PLO(wild type PLO，wtPLO)反应。说明5株mAbs可以用于wtPLO的检测。由于2G3的ELISA反应效价显著高于其他4株mAbs，因此使用2G3作为捕获抗体，配合本实验室已保存的HRP标记的抗PLO mAb（HRP-AP-1A3）建立并优化了双抗体夹心ELISA方法。根据此方法检测不同培养时间内T.pyogenes HLJ-0912株和T.pyogenesHLJ-1005株分泌在培养液中的wtPLO含量，并在T.pyogenes HLJ-0912株培养到10-14h之间时可以检测到其培养物中的PLO含量。
　　综上所述，本研究成功制备了5株mAbs，并确定了其所针对的2个表位区;且表明了能够识别十一肽基序的mAbs可以有效抑制PLO的溶血活性。同时使用双抗体夹心ELISA方法对T.pyogenes HLJ-0912株分泌在液体培养基内的PLO进行定量分析，为T.pyogenes的毒力分析提供了依据。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1．4 T. pyogenes检测方法

1．1．5 T. pyogenes的治疗

1．2 PLO的概述

1．2．2 PLO的结构与成孔机制

1．2．3 D4结构域对PLO溶血活性的影响

1．3 CDCs与mAbs

1．3．1 mAbs概述及应用

1．3．2 抗CDCs mAbs的研究概况

1．4 研究目的与意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 细胞与菌株

2．1．2 试验动物

2．1．3 感受态与质粒

2．1．4 酶、抗体及试剂盒

2．1．5 细胞培养相关试剂

2．1．6 生化试剂

2．1．7 主要溶液的配制

2．1．8 主要设备仪器

2．2 试验方法

2．2．1 rPLO及rPLO D4的表达与纯化

2．2．2 wtPLO蛋白的制备

2．2．3 免疫动物程序

2．2．4 间接ELISA方法的建立

2．2．5 PLO D4mAbs的制备

2．2．6 杂交瘤细胞的冻存与复苏

2．2．7 抗PLO D4的mAbs的鉴定

2．2．8 Western-blot法分析mAbs所针对的表位区

2．2．9 双抗体夹心ELISA方法的初步建立

2．2．10 双抗体夹心ELISA方法检测T. pyogenes培养物wtPLO的含量

3 结果与分析

3．1 rPLO及rPLO D4蛋白的制备

3．1．1 rPLO蛋白的制备

3．1．2 rPLO D4蛋白的制备

3．2 抗PLO D4的mAbs的制备及鉴定

3．2．1 抗PLO D4的mAbs的制备

3．2．2 抗rPLO D4 mAbs的鉴定

3．3 rPLO溶血活性及mAbs抗溶血活性测定

3．3．1 rPLO及wtPLO溶血活性的测定

3．3．2 mAbs抗溶血活性测定

3．4 mAbs所针对表位区的鉴定

3．5 mAbs的初步应用

3．5．1 双抗体夹心ELISA方法的初步建立

3．5．2 双抗体夹心ELISA方法的条件优化

3．5．3 双抗体夹心ELISA检测T. pyogenes培养物中wtPLO的含量

4 讨论

4．1 抗PLO D4 mAbs的制备

4．2 mAbs针对PLO D4表位区的筛选

4．3 双抗体夹心ELISA方法的建立

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文