白桦愈伤组织再生系统的体细胞无性系变异研究

摘要

本文以白桦(Betulaplatyphalla)5个优良无性系为研究材料，取叶片作为外植体，用IS附加不同浓度的BA作为培养基，对白桦愈伤组织再生途径的快繁系统进行了研究；同时对愈伤组织及其再生植株的染色体数目变异进行了研究，对基因组DNA变异进行了AFLP分析，结果如下：1.筛选出IS+(3～5mg/L)BA+0.5mg/LKT+2％蔗糖是诱导白桦愈伤组织繁殖的最优培养基，诱导率达到80％以上；诱导产生的愈伤组织，在IS+0.4mg/LBA+2％蔗糖分化培养基中出芽率高达90％以上。 2.建立了白桦叶片直接出芽的再生系统：即在IS+(10.0～15.0mg/L)BA+0.5mg/LKT+2％蔗糖诱导20天，然后在IS+0.4mg/LBA+2％蔗糖分化培养基中培养15天能达到直接出芽，每片叶片的丛生芽多达20～30个，质量较高。 3.体细胞无性系的染色体数目变异模式：利用BA诱导的愈伤组织及其再生植株的染色体数目均发生不同程度的变异，随着BA浓度的增加，再生植株二倍体细胞比例由50％逐渐下降到39.75％；由5.0mg/LBA诱导的愈伤组织再生植株与对照相比染色体数目变异较小，变异率为40.75％；另外，随着继代培养时间的增加，再生植株二倍体细胞比例由57％剧减到30％。 4.体细胞无性系的DNA水平变异模式：随着BA浓度的提高，再生植株的DNA多态性片段的比例明显提高，由BA低浓度时的38.73％上升到高浓度时的61.33％；继代1～5次的再生植株多态性片段比例依次为61.78％、74.91％、76.13％、72.51％和78.81％，这表明随着继代次数的增加，再生植株的DNA多态性片段比例逐渐上升，变异逐渐加大。5.通过细胞学观察和DNA水平分析，确定高浓度激素和继代次数的增加是导致白桦体细胞无性系变异产生的重要原因。 6.完善了适合于白桦总DNA多态性分析的AFLP技术，筛选出适合于白桦AFLP分析的13对引物组合。 7.选出IS+5.0mg/LBA+0.5mg/LKT+2％蔗糖是使白桦快速繁殖，再生植株变异较小的培养基，其再生植株继代培养应控制在5代以内。 8.建立了白桦愈伤组织染色体制片技术：即取培养一周的愈伤组织，用0.2％的秋水仙素预处理1.5～2h，固定后用1NHCl在室温(18～20℃)解离10～15min或室温下用2％纤维素酶和果胶酶混合液酶解30min，压片后易获得分散、染色效果好的细胞分裂中期染色体图象。 9.初步建立了白桦愈伤组织化学诱变技术：在高浓度EMS短时间处理和低浓度EMS长时间处理条件下可获得到叶柄、叶片愈伤组织的半致死剂量；通过观察半致死剂量下愈伤组织细胞的染色体数目发现，诱变后细胞中单倍体、非整倍体及多倍体细胞比例均显著高于对照，总变异率由诱变前60％提高到89.93％，这说明EMS对白桦愈伤组织的诱变作用是显著的。

目录

文摘

英文文摘

1前言

1.1白桦简介

1.2桦木组织培养概述

1.3植物组织培养中的体细胞无性系变异

1.4体细胞无性系变异的细胞遗传学基础

1.4.1细胞的全能性

1.4.2体细胞无性系变异与愈伤组织和不定芽的关系

1.4.3体细胞胚胎再生

1.4.4细胞的异常分裂机制

1.5体细胞无性系的细胞学变异

1.6体细胞无性系变异的分子遗传学基础及表现

1.6.1基因突变

1.6.2 DNA总量的变化

1.6.3 DNA甲基化变化与体细胞无性系变异

1.6.4植物转座子活化与体细胞无性系变异

1.6.5细胞器DNA的变化

1.7植物组织培养中无性系变异产生的主要原因

1.7.1外植体来源及预先存在的变异

1.7.2培养基中外源激素

1.7.3周期性继代、重复再生和离体保存的时间

1.7.4较高的增殖率

1.8体细胞无性系变异的广泛性和普遍性

1.9体细胞无性系变异对植物品种改良的意义

1.10体细胞无性系变异的分子检测

1.10.1酶谱分析检测变异

1.10.2 RFLP检测变异

1.10.3 RAPD检测变异

1.10.4 AFLP检测变异

1.11现存的问题与研究前景

1.12本研究目的与意义

2材料和方法

2.1实验材料

2.1.1植物愈伤组织及再生植株的诱导材料

2.1.2再生植株染色体变异的材料

2.1.3体细胞无性系变异AFLP扩增的材料

2.1.4化学诱变材料

2.1.5酶及化学试剂

2.1.6主要仪器设备

2.1.7分析软件

2.1.8所用溶液及配制

2.2实验方法

2.2.1培养条件

2.2.2愈伤组织诱导及培养

2.2.3愈伤组织的分化

2.2.4再生植株的壮苗生根

2.2.5愈伤组织染色体观察方法的研究

2.2.6愈伤组织及再生植株染色体统计

2.2.7 CTAB法提取DNA

2.2.8限制性内切酶与节头连接

2.2.9预扩增反应条件

2.2.10选择性扩增反应条件

2.2.11凝胶分析

2.2.12银染

2.2.13数据统计与分析方法

2.2.14白桦化学诱变技术的研究

3结果与分析

3.1白桦愈伤组织快速繁殖培养基中激素浓度的选择

3.1.1不同BA浓度对叶片愈伤组织诱导率的影响

3.1.2不同BA浓度诱导的叶片愈伤组织分化情况

3.2白桦叶片直接出芽快速繁殖系统的建立

3.3愈伤组织再生植株的壮苗生根

3.4白桦愈伤组织染色体观察方法的研究

3.4.1取材时间对愈伤组织制片的影响

3.4.2预处理时间对染色体形态的影响

3.4.3解离条件对染色效果的影响

3.5白桦组织培养过程中的体细胞无性系变异研究

3.5.1不同BA浓度对愈伤组织染色体数目变异的影响

3.5.2不同浓度BA对再生植株染色体数目变异的影响

3.5.3继代次数对再生植株染色体数目的影响

3.5.4再生植株的AFLP分析

3.6白桦愈伤组织化学诱变技术的研究

3.6.1不同EMS浓度及浸泡时间对白桦愈伤组织诱变效果的影响

3.6.2培养基中加入EMS对于白桦愈伤组织诱变效果的影响

3.6.3叶柄和叶片愈伤组织在半致死剂量条件下的染色体变异

4讨论

4.1影响愈伤组织诱导和分化的因素

4.1.1外源激素

4.1.2继代培养时间

4.2影响愈伤组织染色体制片的主要因素

4.3影响体细胞无性系变异的主要因素

4.3.1激素水平

4.3.2继代培养

4.4获得高分辨率AFLP凝胶图的几个关键问题

4.4.1 DNA模板的质量

4.4.2限制性内切酶及引物的选择

4.4.3电泳过程中应注意的几个问题

4.4.4预扩增产物稀释倍数的选择

4.4.5银染时一些细节的把握

4.5愈伤组织与再生植株之间的变异频率比较

4.6细胞学变异与分子水平变异之间的联系

4.7诱变技术在白桦组织培养中的应用

5结论

6参考文献

附录A

附录B

攻读学位期间发表的学术论文

致谢