水稻（Oryza sativa L.）碳酸酐酶基因在逆境胁迫下的功能解析

摘要

碳酸酐酶(Carbonicanhydrase，CA，EC4.2.1.1)是一种含Zn2+金属酶，它广泛的存在于动物、植物、细菌和微生物中。CA被认为是一种与光和作用密切相关的酶，但近些年的研究表明它与环境逆境之间也存在着一定的应答关系。基于CA特异性的催化CO2和HCO3-之间的可逆反应(CO2+H2OO(→)HCO3-+H+)，本论文以农作物水稻为主要实验材料，针对我国东北地区苏打盐碱地的碳酸盐逆境(NaHCO3、Na2CO3)为研究对象，采用分子生物学手段，对水稻CA基因与环境逆境的关系作了初步的探讨。主要得到如下结果： 逆境胁迫对水稻生长影响的比较试验发现：NaHCO3胁迫对水稻生长的影响要大于NaCl胁迫，并且在NaHCO3逆境条件下根系受到的胁迫较地上部更严重。与NaCl逆境相比NaHCO3逆境不仅提供了高Na+、高pH值，同时HCO3-也是影响植物生长，阻碍植物发育的一个重要因素。 用Northern杂交方法对水稻CA基因在不同逆境下mRNA水平上的转录特性进行了分析，实验结果表明CA基因在转录水平上分别不同程度的受到了盐(NaHCO3、Na2CO3、NaCl)和干旱(PEG)逆境的诱导，并且随着胁迫时间的增加，CA基因的表达量有着不同程度的增加。从蛋白质表达水平上分析表明，在受到逆境胁迫时CA的特异酶活性有明显增高，这些结果说明了水稻CA基因与逆境之间存在着一定的应答关系。为了更进一步的研究水稻CA基因与逆境的关系，实验中将水稻CA基因克隆到植物表达载体pBI121上，并利用农杆菌介导的真空转化法将CA基因转入到拟南芥中。通过Northren杂交检测证明实验获得了相互独立并稳定遗传的转基因株系。抗盐性试验中转基因拟南芥在5mMNa2CO3、50mM和100mMNaCl浓度下能够正常的生长，而野生型拟南芥植株叶片变黄、根系生长缓慢。实验结果表明，转入水稻CA基因的拟南芥具有一定的盐耐受性。 将CA基因与绿色荧光蛋白GFP基因融合，构建到植物表达载体PBI121上。提取转基因拟南芥的原生质体，用荧光染料MitoTrackerRedCmxRos(MolecularProbes)染色。利用激光共聚焦显微镜观察(ConfocalLaserScanningBiologicalMicroscope,OLYMPUS)观察，从而对CA基因编码的蛋白在植物细胞中进行了定位。实验结果证明：CA基因编码的蛋白存在于细胞的线粒体，这个结果与我们最初预测的CA基因编码的蛋白在细胞内的存在位置结果一致。 利用大肠杆菌体外表达技术，将水稻CA基因构建到原核表达载体pGEX-6p-3中，并将pGEX-6p-3-CA质粒导入EcoliBL21菌株，通过对诱导温度以及IPTG浓度等条件的调整，利用Glutathione-Sepharose4B和ATP-Mg溶液对融合蛋白进行纯化，得到了纯的GST-CA的融合蛋白。另外，利用蛋白酶PreScissionProtease对融合蛋白GSTCA进行了切割，获得了高纯度、高得率的活性CA蛋白。每克干细胞纯化得率为CA蛋白19mg。纯化的得到的CA酶活性受到来自于磺胺类物质(Acetazolamide)和阴离子(N3-、NO3-、I-、Br-、Cl-)的抑制，同时它不具有显著的酯酶活性，Zn2+能够帮助CA更好的保持活性。所获蛋白的质量与数量，足够用于制备抗体，这对今后在蛋白质水平上研究CA与逆境的应答关系奠定了良好的基础。

目录

文摘

英文文摘

1绪论

2氯化钠和碳酸氢钠胁迫下水稻的生长特性

3水稻CA基因与逆境关系的研究

4水稻CA基因的重组蛋白在E.coli中的表达纯化与特性研究

结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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