NaHCO胁迫下刚毛柽柳基因表达谱的建立及相关基因的克隆

摘要

刚毛柽柳(Tamarix hispid)为灌木或小乔木，具有强的抗旱、耐盐、耐水湿、抗沙埋能力，是优良的防风固沙、水土保持和盐碱地造林树种。而且能在含盐量1％的盐碱地上形成自然林，为盐碱土指示植物，是进行植物抗盐碱研究的理想材料。本文研究了刚毛柽柳在盐碱胁迫后不同时间点基因的表达，并克隆出抗逆相关基因。 刚毛柽柳在0.4 mol/LNaHCO<,3>胁迫下，分别处理0h(对照)、24 h和52h，以叶片为材料，分别构建了3个全长cDNA文库。文库的滴度分别为7.5×10<'5>pfu、2.6×10<'6>pfu、4.0×10<'6>pfu，插入片段平均长度分别为1.1、1.2和1.2 kb，平均重组率为97.5％。 共获得9447条高质量的ESTs序列，其登录号为EH048198-EH057644。它们代表了3945条单一基因序列(Unigene)，包括986个contigs和2959个singlets。3个文库具有的Unigene分别是1752、1558和1675。将9447条EST序列与GenBank的Nr数据库进行Blastx和Blastn分析，其qb7365条ESTs(占77.96％)与已知基因序列相似性高(E-value<10<'-4>)，其余2082(22.04％)条相似性低或没有相似性。与已知基因序列相似性高的7365条序列按功能分为12类，其中光合(photosynthesis)占20.31％，功能未知(functionunknown)占13.97％、细胞防御(Cell rescue，defense)占13.96％、能量(Energy)占7.59％、蛋白质合成(Protein synthesis)占7.58％、转运(Transport facilitation)占7.28％、转录(Transcription)占6.63％、细胞结构(Cell structure)占6.07％、代谢(Metabolism)占5.70％、蛋白质定位(Protein destination)占5.02％、信号转导(Signaltransduction)占3.86％、细胞生长/分裂(Cell growth，division)占2.04％。 通过对3个cDNA文库分别进行EST分析和比较建立了NaHCO<,3>胁迫不同时间点的柽柳基因表达谱，鉴定了大量的盐碱胁迫响应基因。这些基因按功能可以分为：渗透调节、激素信号转导、活性氧清除、转录调控、蛋白合成和定位、离子平衡、核糖体蛋白、光合作用和代谢等。提示这些途径都可能参与了刚毛柽柳的耐盐碱胁迫。 在文库中选择了9个表达明显差异的基因，利用实时定量(real time)RT-PCR技术，研究比较了这些基因在NaCl和NaHCO<,3>胁迫下基因表达模式，发现在NaCl或NaHCO<,3>胁迫24 h后这些基因表达趋势比较相似。但在胁迫52 h后，这些基因对NaCl和NaHCO<,3>胁迫响应表达趋势出现明显差异。 文库中含有较多的抗逆相关全长基因，从中选择了液泡膜H<'+>-ATPase C、c″亚基和2个GRP(glycine-rich RNA-binding protein)基因，对它们在NaHCO<,3>和NaCl胁迫下基因的表达进一步的分析。NaCI胁迫后 ThVHA cl和 Th VHA c″1，表达量明显增加，ThGRP1和ThGRP2基因表达量下降；NaHCO<,3>胁迫后 Th VHA cl 和 ThVHA C″1的表达量在24 h下降，52 h上升，而ThGRP1和ThGRP2为24 h上升，52 h下降。 本研究发现刚毛柽柳对盐碱胁迫的响应涉及多个生理和代谢途径，并鉴定了一系列胁迫应答基因。这些结果可以作为木本植物耐盐的分子遗传研究的模式系统，使我们在分子水平上对木本植物耐盐机理有了进一步的认识。同时，丰富了林木基因工程育种理论，为抗逆基因工程育种提供一些优良的抗性基因。

目录

文摘

英文文摘

声明

1绪论

1.1引言

1.2植物耐盐机理研究

1.2.1渗透调节

1.2.2离子摄入和区域化

1.2 3活性氧清除

1.3植物基因组学研究

1.3.1植物结构基因组学

1.3.2植物功能基因组研究

1.3.3植物比较基因组学研究

1.4 EST在植物功能基因组学研究中的应用

1.5刚毛柽柳简介

1.5.1刚毛柽柳的生物学特征

1.5.2将刚毛柽柳作为研究对象的可行性

1.6本项研究的目的和意义

1.7本项研究的内容和技术路线

2柽柳cDNA文库的构建

2.1试验材料

2.1.1植物材料

2.1.2试剂

2.2试验方法

2.2.1总RNA的制备与纯化

2.2.2 cDNA文库的构建及滴度的测定

2.3结果分析

2.3.1 RNA的检测

2.3.2 cDNA第一链的LD-PCR(Long Distance PCR)

2.3.3 cDNA文库的质量评价

2.4讨论

2.5本章小结

3 NaHCO3胁迫下柽柳叶片基因表达谱的建立

3.1材料与方法

3.1.1试验材料

3.1.2试验方法

3.1.3序列的编辑与分析

3.2结果与分析

3.2.1大规模质粒提取

3.2.2 EST序列基本统计分析

3.2.3 3945个Unigenes在3个文库中的分布特征

3.2.4基因表达频率及高丰度表达基因分析

3.2.5 EST序列同源性比较分析

3.2.6 NaHCO3胁迫后基因的上调和下调表达

3.3讨论

3.3.1 NaHCO3胁迫下柽柳基因表达谱的建立

3.3.2柽柳可能的耐盐途径

3.4本章小结

4不同盐胁迫下柽柳基因表达的差异

4.1材料与方法

4.1.1实时(Real-time)荧光定量PCR

4.1.2数据分析

4.2结果分析

4.3讨论

4.4本章小结

5柽柳抗逆相关基因的克隆及表达分析

5.1材料与方法

5.1.1全长序列的克隆

5.1.2基因的序列分析

5.1.3荧光定量PCR检测NaHCO3和NaCl胁迫下基因的表达

5.2结果分析

5.2.1序列分析

5.2.2基因表达研究

5.3讨论

5.3.1柽柳液泡膜H+-ATPase基因结构和功能

5.3.2柽柳富含甘氨酸RNA结合蛋白基因结构和功能

5.4本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢