一种基于锚定PCR的微卫星筛选新方法的研究

摘要

微卫星是一种广泛应用的遗传标记。随着研究的不断深入，要求从基因组中大量筛选微卫星位点。传统的筛选方法虽然被普遍采用，但仍存在着许多缺点和不足，如需要构建基因文库、内切酶的使用以及筛选出的位点重复率高等。文库构建耗时、费力，且对技术、经验要求较高；由于内切酶切点分布的随机性，许多微卫星位点克隆中仅保留极少部分侧翼序列，因而无法设计引物；重复率高耗费了大量的经费和劳动力。本研究创建了一种基于锚定PCR的筛选方法，从东北虎基因组中筛选了大量的微卫星位点，有效克服了上述问题。 首先进行一个单引物PCR，在微卫星重复区内设计单引物Str-ACN，并在引物3'末端锚定一个碱基。然后利用末端脱氧核糖核酸转移酶在PCR产物的3'末端上加一poly-C结构。再利用另行设计的引物GG-N与Str-ACN配对进行双引物扩增，扩增产物克隆测序后，得到的就是微卫星位点的下游序列。根据此下游序列再设计一个引物Nest1，利用相同的原理向上游扩增，克隆测序得到上游序列，这样就得到了完整的微卫星位点。最终本研究通过这种筛选方法，在第一次克隆测序的149个样品中共得到147个不同的微卫星位点的下游序列。从中随机抽取26个微卫星位点用于上游序列的扩增和测序，共得到24个完整的微卫星位点。

目录

文摘

英文文摘

声明

1绪论

1.1微卫星DNA

1.1.1微卫星的发现

1.1.2微卫星的结构与分类

1.1.3微卫星的分布

1.1.4微卫星的特点

1.1.5微卫星的多态性机理

1.1.6微卫星的生物学功能

1.2微卫星的应用

1.2.1构建DNA指纹图

1.2.2构建基因图谱

1.2.3数量性状位点(QTL)定位

1.2.4亲权鉴定与品系鉴定

1.2.5群体遗传多样性的研究

1.2.6遗传病的预测及诊断

1.2.7濒危动物的保护

1.3微卫星的获得

1.3.1从公共数据库中查找微卫星位点

1.3.2从相近物种获得微卫星引物

1.3.3从基因组DNA中筛选微卫星位点

1.4本研究的意义

2材料、原理与方法

2.1实验材料

2.2实验原理

2.2.1第一轮锚定PCR扩增

2.2.2第二轮巢式PCR扩增

2.3实验方法

2.3.1 DNA提取

2.3.2 DNA浓度测定

2.3.3 3'端侧翼序列的获得

2.3.4 5'端侧翼序列的获得

3结果

3.1 DNA提取的结果

3.2引物扩增、回收的检测结果

3.3一次克隆检测的结果

3.4次克隆检测的结果

3.5 3'侧翼序列的测定结果

3.6 5'侧翼序列的测定结果

3.7可用位点的分析结果

4讨论

4.1本方法的优越性

4.1.1无需使用内切酶

4.1.2筛选位点的重复率低

4.1.3无需杂交富集

4.2本方法应用时需要注意的问题

4.2.1基因组DNA的质量

4.2.2单引物的设计

4.2.3 PCR产物检测

4.2.4阳性克隆的检测

4.2.5出现的RAPD类似产物

4.3本方法需要继续完善的问题

4.4分离策略的最优化

4.5微卫星位点多态性评价

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢