表达AIV H7HA和H9HA基因重组鸭瘟病毒载体的构建与DNA疫苗研究

摘要

禽流感(Avian Influenza，AI)是由A型流感病毒引起的禽类感染和/或疾病综合征，自1878年首次于意大利报道以来，目前已普遍存在于世界上许多国家和地区，给养禽业造成了巨大的经济损失。高致病性禽流感(HPAI)多以突然发病和高死亡率为主要特征，常常导致感染鸡群的全部死亡，被世界动物卫生组织(OIE)列为A类烈性传染病。 本研究首先根据GenBank所发表的AIV H7亚型HA基因的cDNA序列，利用Primer5.0软件，设计一对引物，以本实验室所保存的pMD18-T-H7-HA阳性质粒为模板扩增出H7HA基因；通过RT-PCR技术扩增了禽流感分离株CK/MJ/0823/00(H9N2)的H9亚型HA基因，并进行序列测定与分析。结果表明：经AIV H7亚型HA基因测序和序列分析，H7HA基因由起始密码子到终止密码子的核苷酸长为1692bp，编码563个氨基酸残基，与其它17个国内外参考毒株的核苷酸和推导氨基酸同源性比较，核苷酸的同源性为76.3％-84.3％，推导氨基酸同源性为83.3％-93.2％；CK/MJ/0823/00(H9N2)分离株H9亚型HA基因测序及序列分析结果为：H9HA基因ORF长为1683bp，编码560个氨基酸残基，与其它17个国内外参考毒株的核苷酸和推导氨基酸同源性比较，核苷酸的同源性为67.1％-95.1％，推导氨基酸的同源性为91.9％-99.7％。 将克隆到pMD18-T载体的H7和H9亚型HA基因亚克隆到载体p-3-3.1的多克隆位点中，构建AIV H7HA和H9HA基因的重组克隆载体p-3-3.1-H7-HA和p-3-3.1-H9-HA。接下来分别将鉴定正确的重组质粒p-3-3.1-H7-HA和p-3-3.1-H9-HA用Xho Ⅰ单酶切，分别回收携带真核表达元件H7HA和H9HA的基因。转移载体质粒pUC-TK2.9-LacZ经Xho Ⅰ酶切，去磷酸化后回收。再将携带真核表达元件H7HA和H9HA的基因通过Xho Ⅰ位点亚克隆到含有鸭瘟病毒复制非必需片段的pUC-TK2.9-LacZ转移载体质粒的Xho Ⅰ位点上，从而分别成功构建携带真核表达元件含有目的基因H7HA和LacZ报告基因及鸭瘟病毒复制非必需区的DPV转移载体质粒和携带真核表达元件含有目的基因H9HA和LacZ报告基因及鸭瘟病毒复制非必需区的DPV转移载体质粒，分别命名为pUC-TK2.9-LacZ-H7-HA和pUC-TK2.9-LacZ-H9-HA。最后将AIV能诱导宿主产生保护性免疫反应的主要抗原基因H7HA和H9HA作为候选基因，以具有CMV启动子的真核表达载体pcDNA3.1(+)作为载体，构建了含有以上两种基因的DNA疫苗。 将以上构建的两种DNA疫苗转染MDCK细胞进行瞬时表达，结果在转染后48h两种质粒均获得了表达，且表达的蛋白可与抗AIV的抗体发生特异性结合，于荧光显微镜下可见绿色荧光，而质粒pcDNA3.1(+)及未转染质粒的MDCK细胞均未出现荧光，呈阴性反应。体外转染实验表明，两种疫苗质粒均能在体外获得表达，从而为下一步的动物试验提供了必要的前提条件。 为了评价所构建的两种DNA疫苗的免疫效果，分别将其以每只鼠100μg的剂量分两点肌肉注射接种6-8周龄BALB/C小鼠，同时以质粒pcDNA3.1(+)和PBS作对照。2周后加强免疫，隔2周后进行第三次免疫。各组免疫鼠在首次免疫前、后(加强免疫前)、加强免疫后(第三次免疫前)及第三次免疫后2周分别采血，用HI和ELISA的方法检测抗体的动态变化，同时检测外周血CD4<'+>、CD8<'+>T淋巴细胞的动态变化。结果显示：(1)免疫前各DNA疫苗免疫组检测不到HI抗体，但免疫后各DNA疫苗组的HI抗体效价迅速升高；(2)ELISA检测结果显示，各DNA疫苗免疫组均不同程度的产生了抗体；(3)各DNA疫苗免疫组在免疫后外周血CD4<'+>、CD8<'+>T淋巴细胞都有不同程度的升高。通过本研究证实，所构建的DNA疫苗能够诱导BALB/C小鼠的体液免疫和细胞免疫应答。本研究克隆了AIV H7亚型HA基因和CK/ MJ/0823/00(H9N2)分离株H9亚型HA基因，利用基因重组技术分别构建了含有H7HA和H9HA基因的重组鸭瘟病毒转移载体；又将AIV H7HA和H9HA基因分别插入含有CMV启动子的真核表达载体pcDNA3.1(+)的多克隆位点中，从而分别成功构建了含有AIV H7HA和H9HA两种保护性抗原基因的DNA疫苗并进行了体外瞬时表达和动物体内接种试验。总之，通过本研究将为水禽流感病毒病的诊断试剂和疫苗研制提供科学的实验依据，奠定良好的技术基础和物质储备。

目录

文摘

英文文摘

声明

1绪论

1.1课题背景

1.2禽流感病毒的分子生物学研究进展

1.2.1禽流感病毒粒子的结构

1.2.2 AIV基因组及其编码的蛋白质

1.2.3流感病毒的复制

1.2.4血凝素(Hemagglutinin,HA)与禽流感病毒致病性的关系

1.3水禽流感研究进展

1.3.1水禽流感的历史

1.3.2水禽在禽流感流行病学中的意义

1.3.3水禽流感的公共卫生意义

1.4 DNA疫苗的研究进展

1.4.1 DNA疫苗的组成与分类

1.4.2 DNA疫苗的免疫机制

1.4.3 DNA疫苗的特点

1.4.4影响DNA疫苗免疫效果的因素

1.4.5 DNA疫苗研究需要解决的几个问题

1.5鸭瘟病毒载体研究进展

1.5.1鸭瘟病毒的生物学及分子生物学特征

1.5.2鸭瘟病毒转移载体的构建策略

1.6本研究的目的和意义

2材料和方法

2.1实验材料

2.1.1实验动物

2.1.2质粒与菌种

2.1.3血清与抗体

2.1.4主要试剂

2.1.5主要实验仪器与设备

2.2实验方法

2.2.1引物设计

2.2.2 AIV的增殖与初步纯化

2.2.3 AIV总RNA的提取

2.2.4反转录合成cDNA

2.2.5 H7HA和H9HA基因的克隆与序列分析

2.2.6重组克隆载体p-3-3.1-H7-HA和p-3-3.1-H9-HA的构建

2.2.7表达AIV的H7HA、H9HA基因重组鸭瘟病毒转移载体的构建

2.2.8 H7HA和H9HA基因的DNA疫苗质粒的构建

2.2.9重组真核表达质粒在MDCK细胞中的瞬时表达

2.2.1 0瞬时表达的检测

2.2.11 DNA疫苗的免疫保护效果

2.3本章小结

3实验结果

3.1 H7HA和H9HA基因的克隆与序列分析

3.1.1 H7HA和H9HA基因的PCR扩增结果

3.1.2重组质粒pMD18-T-H7-HA(H9-HA)的酶切鉴定

3.1.3 H7和H9亚型HA基因的序列测定与分析

3.2重组克隆载体p-3-3.1-H7-HA和p-3-3.1-H9-HA的构建

3.2.1重组质粒p-3-3.1-H7-HA的鉴定

3.2.2质粒p-3-3.1-H7-HA携带真核表达元件的H7HA基因的鉴定

3.2.3重组质粒p-3-3.1-H9-HA的鉴定

3.2.4质粒p-3-3.1-H9-HA携带真核表达元件的H9HA基因的鉴定

3.3表达AIV的H7HA和H9HA基因重组鸭瘟病毒转移载体的鉴定

3.3.1含H7HA基因的鸭瘟病毒转移质粒的酶切结果

3.3.2含H9HA基因的鸭瘟病毒转移质粒的酶切结果

3.3.3 DNA疫苗质粒的酶切鉴定

3.4 DNA疫苗在MDCK细胞中的瞬时表达检测

3.4.1转染后的PCR检测

3.4.2瞬时表达产物的荧光检测

3.4.3表达产物的SDS-PAGE分析

3.4.4表达产物的Western blotting分析

3.4.5表达产物的Dot-ELISA分析

3.5 DNA疫苗的免疫效果

3.5.1制备抗原的检测结果

3.5.2抗体的检测

3.5.3 T细胞亚类检测

3.6本章小结

4讨论

4.1关于禽流感病毒HA基因

4.2重组鸭瘟病毒转移载体的构建

4.3关于杆状病毒-昆虫细胞系统表达蛋白的优缺点

4.4关于AIV H7HA和H9HA基因的真核表达

4.4.1培养基中的血清

4.4.2载体细胞的选择

4.4.3瞬时和稳定表达

4.4.4重组质粒在真核细胞中表达的检测

4.5 ELISA诊断方法的研究

4.6 DNA疫苗的研究

4.7本章小结

4.7.1禽流感病毒HA基因是影响AIV毒力的主要影响因素

4.7.2重组鸭瘟病毒转移载体的构建对防控水禽传染病的意义

4.7.3杆状病毒-昆虫细胞系统表达蛋白的优点

4.7.4选择载体细胞系对转染效率的影响

4.7.5 DNA疫苗的主要特点

结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢