芜菁花青素生物合成相关催化酶基因的克隆及UV-A诱导表达

摘要

植物的色素主要有三大类:甜菜碱类、类胡萝卜素和花青素类。花青素是存在于植物中的水溶性色素，大约88％的被子植物的花颜色是由花青素决定的。花青素主要积累在植物液泡中，具有多种生理功能，例如吸引昆虫传粉，抵御低温和紫外线伤害，以及防治病虫害、抗氧化衰老等。花青素生物合成代谢途径是类黄酮途径的一个分支，其调控机制的相关研究已成为生命科学研究的热点之一。花青素生物合成途经中有很多重要的催化酶参与，如苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase，PAL)是苯丙烷类代谢第一步反应的催化酶;苯基苯乙烯酮黄烷酮异构酶(chalcone-flavanone isomerase，CHI)催化苯基苯乙烯酮发生分子内反应;黄烷酮-3-羟化酶(flavanone3-hydroxylase，F3H)可以催化4，5，7-三羟基黄烷酮生成二氢堪非醇。
　　本研究以花青素生物合成依光型津田芜菁和非依光型赤丸芜菁为试材，利用RT-PCR方法分别克隆了花青素合成的主要催化酶基因PAL、 CHI和F3H的全长eDNA序列。利用两个品种间PAL、CHI和F3H基因高度同源序列设计引物合成探针。利用UV-A处理津田芜菁和赤丸芜菁未见光块根0h、6h、12h、18h、24 h和48 h，通过Northern杂交技术检测PAL、 CHI和F3H基因的表达量变化情况。主要研究结果如下：
　　(1)津田芜菁和赤丸芜菁的PAL全长基因的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)均为2169 bp，编码722个氨基酸，在GenBank中的登录号分别为EU402423.1和EU402424.1。两种芜菁PAL基因的核苷酸序列与甘蓝型油菜(Brassica napus)PAL-1的同源性达99％，PAL氨基酸序列与甘蓝型油菜PAL的同源性达99％。从第67到第532的氨基酸序列含有PAL结构域。津田芜菁和赤丸芜菁PAL基因的核苷酸序列在9个位置上存在差异，推导的氨基酸序列在3个位置上存在差异。
　　津田芜菁和赤丸芜菁的CHI全长基因的ORF均为756 bp，编码251个氨基酸，在GenBank中的登录号为EU402416.1和EU402417.1。两种芜菁基因的核苷酸序列与萝卜(Raphanus sativus) CHI的同源性达95％，CHI氨基酸序列与萝卜CHI的同源性达91％。从第11到第222的氨基酸序列含有CHI结构域。津田芜菁和赤丸芜菁CHI基因的核苷酸序列在3个位置上存在差异，推导的氨基酸序列在3个位置上存在差异。
　　津田芜菁和赤丸芜菁的F3H全长基因的核苷酸序列完全相同，ORF为1077 bp，编码358个氨基酸，在GenBank中的登录号为EU402422.1。核苷酸序列与甘蓝型油菜(Brassicanapus) F3H-1的同源性达98％，推导的氨基酸序列与甘蓝型油菜F3H-1的同源性达99％，从第35到第342的氨基酸序列含有F3H相关的结构域。
　　(2) Northern杂交结果表明，UV-A可以诱导津田芜菁和赤丸芜菁PAL、 CHI和F3H基因的表达，PAL、 CHI和F3H基因的表达量与UV-A处理时间存在相关关系。

目录

摘要

1 绪论

1．1 引言

1．2 花青素合成途径及相关基因

1．2．1 花青素生物合成的主要催化酶

1．2．2 花青素生物合成的调节基因

1．3 外界环境和内在因素对植物色素生物合成的影响

1．4 本项研究的目的与意义

2 PAL、CHI和F3H基因的克隆

2．1 试验材料

2．2 试验试剂

2．2．1 芜菁RNA提取试剂

2．2．2 LB培养基

2．2．3 质粒提取试剂

2．2．4 酶和其他生化试剂

2．3 试验方法

2．3．1 芜菁块根皮总RNA的提取

2．3．2 RT-PCR反应

2．3．3 PCR产物的回收纯化及与载体的连接

2．3．4 转化

2．3．5 质粒提取及质粒PCR检测

2．3．6 序列测定

2．4 试验结果

2．4．1 津田芜菁和赤丸芜菁总RNA的提取

2．4．2 PAL、CHI和F3H基因的克隆

2．4．3 PAL、CHI和F3H基因序列比对结果

2．5 讨论

2．6 本章小结

3 PAL、CHI和F3H基因的表达分析

3．1 试验材料

3．2 试验试剂

3．2．1 Northern杂交试剂

3．2．2 其他试剂

3．3 试验方法

3．3．1 芜菁块根皮总RNA提取方法

3．3．2 探针的合成

3．3．3 Northern杂交

3．4 试验结果

3．4．1 探针的合成

3．4．2 Northern杂交结果

3．5 讨论

3．6 本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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