光信号转导因子COP1、HY5的相互作用及遗传转化研究

摘要

光对植物花青素合成的调控，主要通过光受体接受光信号进行信号传递。光信号转导过程中有很多重要的信号因子参与其中。本研究以依光型花青素合成品种津田芜菁（Brassica rapa‘Tsuda’）为试材，克隆了与拟南芥光信号转导因子COP1和HY5高度相似的基因，并分析了其转录表达特性和二者蛋白间的相互作用，为揭示依光型花青素合成的调控的光信号转导机制提供理论基础。得到了以下主要结果:
　　1津田芜菁类BrCOP1、BrHY5基因的克隆及表达特性
　　利用RACE及同源PCR从津田芜菁中克隆了与拟南芥COP1、HY5序列相似的基因，BlastP分析表明其与拟南芥对应的COP1、HY5序列相似性均达90％以上，结构域预测表明COP1中含有Ring和WD-40结构域，HY5中含有bZIP结构域。Northern杂交分析表明津田芜菁幼苗中，红光、远红光、蓝光、UV-B、UV-A处理下COP1、HY5有较高的表达量，表达量没有显著差异，这表明COP1、HY5可能参与了津田芜菁幼苗上述单色光诱导的光反应。在津田芜菁成熟植株中COP1、HY5在叶、花、直根表皮的达量无明显差异，但UV-A处理直根表皮后，COP1、HY5的表达量增多。
　　2津田芜菁COP1与HY5的相互作用
　　利用GAL4系统表达载体，将COP1和HY5分别成功构建入含结合结构域和激活结构域的表达载体，测序验证后共转化酵母，经过缺陷培养基筛选和报告基因检测表明芜菁COP1与HY5蛋白间存在着相互作用。这一结果与拟南芥中已知的结果一致，表明在芜菁中可能存在着与拟南芥中COP1和HY5相似功能的光信号转导途径。
　　3 HY5-dsRNAi表达载体的构建与遗传转化的初步研究
　　为更深入的研究芜菁HY5的生理功能，采用Gateway克隆系统，根据克隆到的津田芜菁HY5基因序列设计RNA干涉引物，成功构建了芜菁HY5双链RNA干涉表达载体:HY5-dsRNAi。
　　采用农杆菌介导的方法转化津田芜菁，对影响芜菁离体再生的遗传转化的各个因素进行了研究。通过对激素种类因素的优化，获得了再生频率达80％左右的离体再生体系，可以满足遗传转化的要求。研究发现，采用TDZ代替前人常采用的BA来与NAA配合更适于津田芜菁的离体再生，适合再生的激素组合为TDZ7.0 mg/L+NAA1.0mg/L。5.0 mg/L AgNO3对芜菁的分化再生是必须的。

目录

摘要

1 绪论

1．1 课题背景

1．2 光受体的研究现状

1．3 光信号转导途径及相关基因

1．4 RNAi及其在植物遗传改良中的应用

1．4．1 RNAi的发现

1．4．2 RNAi作用机制

1．4．3 转基因RNAi技术在植物中的研究进展

1．5 本项研究目的及意义

2 COP1、HY5基因的克隆及在津田芜菁中的表达分析

2．1 试验材料

2．2 试验方法

2．2．1 总RNA提取(CTAB法)及浓度测定

2．2．2 基因全长克隆(RT-PCR及RACE法)

2．2．3 生物素荧光标记探针合成

2．2．4 Northern杂交

2．3 结果与分析

2．3．1 总RNA电泳及浓度检测

2．3．2 津田芜菁COP1、HY5基因全长克隆及同源性分析

2．3．3 津田芜菁COP1、HY5基因的表达特性

2．4 本章小结

2．4．1 结论

2．4．2 讨论

3 COP1与HY5的相互作用分析

3．1 材料与方法

3．1．1 试验材料

3．1．2 酵母双杂交研究津田芜菁COP1和HY5的相互作用

3．2 结果与分析

3．2．1 津田芜菁COP1、HY5真核表达载体的构建

3．2．2 利用GAL4酵母双杂交系统试剂盒检测COP1与HY5的相互作用

3．3 本章小结

3．3．1 结论

3．3．2 讨论

4 芜菁HY5-dsRNAi表达载体构建及其遗传转化

4．1 材料与方法

4．1．1 试验材料

4．1．2 利用Gateway技术构建HY5-dsRNAi表达载体

4．1．3 HY5-dsRNAi植物表达载体转化农杆菌

4．1．4 外植体的获得与接种方式

4．1．5 津田芜菁离体再生体系的初步探讨

4．1．6 农杆菌介导转化津田芜菁

4．2 结果与分析

4．2．1 利用Gateway技术构建HY5-RNAi载体

4．2．2 农杆菌转化子的鉴定

4．2．3 津田芜菁离体再生体系的初步探讨

4．3 本章小结

4．3．1 结论

4．3．2 讨论

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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