农杆菌介导TCS基因导入大豆的遗传转化研究

摘要

大豆是重要的粮食、油料作物，是植物蛋白和油脂的重要来源。在大豆生长期，病虫害的发生，严重影响其产量和质量。天花粉蛋白(TCS)是从葫芦科药用植物栝楼块根中分离得到的单链核糖体失活蛋白，能够抗烟草花叶病毒等7种病毒、稻瘟病菌等9种病原真菌及蚜虫等4类害虫。利用基因工程手段将抗病虫基因转入大豆，具有重要的经济意义。
　　本研究以大豆子叶节为受体材料，采用农杆菌介导法成功地将外源天花粉蛋白基因导入了该受体中，为大豆的遗传转化及抗性育种提供了理论基础和研究材料。主要研究结果如下：
　　以10个大豆品种为材料，筛选得到了再生频率较高的大豆基因型为合丰35、合丰25和黑农35。确定了不同基因型大豆的潮霉素筛选浓度，子叶节分化适宜筛选浓度黑农35为6mg/L、合丰35和合丰25为4mg/L;丛生芽生根筛选浓度黑农35和合丰35为2mg/L、合丰25为1mg/L。
　　以再生率最高的大豆品种合丰35子叶节为材料，优化农杆菌转化系统的影响因素，探讨了预培养时间、菌液浓度、侵染时间等条件对转化效率的影响，得出大豆遗传转化的较优条件:子叶节外植体预培养24h，采用OD600为0.4-0.6的农杆菌菌液侵染30min，共培养3d，遗传转化效果最好。
　　对筛选出的3个大豆品种，利用农杆菌介导法将天花粉蛋白基因导入其组织中，进行遗传转化，共获得44株抗性植株，PCR检测呈阳性的有29株。其中合丰35有19株检测呈阳性，转化率为1.03％;合丰25有7株检测呈阳性，转化率为0.51％;黑农35有3株检测呈阳性，转化率为0.23％。对PCR阳性植株进行PCR-Southern分子杂交检测，全部为阳性，证实外源天花粉蛋白基因已经整合到大豆基因组中。

目录

摘要

1 绪论

1．1 天花粉蛋白基因及其在植物基因工程的应用

1．1．1 天花粉蛋白的基本特性

1．1．2 天花粉蛋白基因在原核及真核生物中的表达

1．1．3 天花粉蛋白对植物病虫的抑制作用

1．2 大豆遗传转化的研究进展

1．2．1 大豆遗传转化的现状

1．2．2 大豆转化再生体系

1．2．3 大豆遗传转化的方法

1．2．4 大豆遗传转化的研究进展

1．3 本研究目的和意义

2 大豆转天花粉蛋白基因的研究

2．1 材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 菌株和质粒

2．1．3 仪器与设备

2．1．4 培养基

2．1．5 药品与试剂

2．2 方法

2．2．1 采用冻融法将植物表达载体导入农杆菌

2．2．2 大豆子叶节再生体系的优化

2．2．3 农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化

2．3 结果与分析

2．3．1 农杆菌的PCR鉴定

2．3．2 大豆子叶节再生性基因型的筛选

2．3．3 抑菌性抗生素浓度的确定

2．3．4 选择性抗生素浓度的确定

2．3．5 转化因子的筛选

2．3．6 转基因植株的获得

2．4 本章小结

3 分子生物学检测及转基因植株的获得

3．1 材料

3．1．1 植物材料和菌株

3．1．2 仪器与设备

3．1．3 药品与试剂

3．2 方法

3．2．1 农杆菌质粒DNA的提取

3．2．2 大豆基因组DNA的提取

3．2．3 抗性植株的PCR检测

3．2．4 抗性植株的PCR-Southern杂交

3．3 结果与分析

3．3．1 大豆基因组DNA的提取

3．3．2 转化植株的PCR检测

3．3．3 转基因植株的PCR-Southern分子杂交检测

3．4 本章小结

4 讨论

4．1 大豆再生频率较高的基因型筛选

4．2 抗生素的筛选和选择

4．3 进一步解决的问题

结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

声明