聚磷菌的筛选及其体内聚磷酸盐推动PHB积累的研究

摘要

PHB是细菌在不利于生长和营养失衡的条件下胞内大量积累的聚羟基酯。其作为合成聚合物的替代品具有很多优点，它不仅具有可生物降解性和生物相容性，而且还能以可再生资源作为生产原料。
　　本研究以污水处理厂的活性污泥为样品，从中筛选出三株高效聚磷菌。对此三株菌从形态特征、生理生化指标、16SrDNA三方面进行鉴定，确认此三株聚磷菌分别为鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、Pseudochrobactrum saccharolyticum、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，并将三株菌分别编号为YPS-1、YPS-2和YPS-3。
　　选取聚磷菌YPS-2进行聚磷培养基及培养条件的优化。本试验设计好氧/厌氧两段式工艺进行微生物胞内合成与积累聚-β-羟基丁酸(PHB)。以菌体生长和聚磷能力为指标，通过摇瓶培养发酵，对培养基中碳源、氮源和磷源进行优化，试验确定的碳源为CH3COONa、氮源为(NH4)2SO4、磷源为KH2PO4。通过单因子试验、正交试验对好氧阶段菌体生长及聚/释磷条件进行优化，得到对聚磷菌YPS-2聚磷的最适培养基成分及其浓度为:碳源浓度1％、氮源浓度0.1％、磷源浓度100 mg/L;最佳条件为:培养基初始pH值为7、培养温度为30℃、接种量为10％、培养时间为72h。优化的聚磷条件为典型周期的研究提供了理论基础。
　　厌氧培养营养成分对菌体释磷及PHB的积累有重要影响，通过对四种营养条件（缺N、缺P、缺N、P、全营养）下，菌体生长、释磷率、PHB积累情况的研究，发现营养均衡有利于菌体生长，但缺少氮源和磷源的培养有利于菌体释磷和PHB的积累，充分说明PHB需在不平衡生长条件下得以积累。
　　好氧/厌氧典型周期中菌体在好氧阶段生长旺盛，厌氧阶段基本不生长;聚磷量和释磷量则随时间的增加而增加，但厌氧释磷需时较长。聚磷量、释磷量、单位质量干细胞中PHB所占比重与时间均存在一定的线形关系，随时间的增加而增加，但其增加幅度各有不同。在最佳发酵条件下，经好氧/厌氧交替培养后菌体聚磷量超过70mg/L、释磷量超过45mg/L、单位质量干细胞中PHB所占比重达55％以上。较好地实现了生物除磷与PHB的积累。
　　为了提高PHB产率，对收集的菌体进行预处理发现SDS/EDTA混合液具有较好的破壁效果。通过正交试验优化PHB提取条件，优化结果为: NaClO浓度为30％、NaClO/CCl4(V/V)=3∶1、温度为40℃、时间为24h。与未优化前的PHB产率相比，优化后PHB大幅提高，大约为优化前的2倍。样品与标准品的红外分析光谱表明，样品中含有PHB，为进一步PHB的提取与定性分析提供了参考。

目录

摘要

1 绪论

1．1 课题背景

1．2 聚磷菌的研究

1．2．1 聚磷菌与聚羟基丁酸

1．2．2 聚磷菌胞内多聚物的研究

1．3 微生物合成PHB及其提取的研究

1．3．1 PHB的结构与性质

1．3．2 细菌合成PHB的研究

1．3．3 PHB的提取与检测

1．3．4 PHB的应用

1．4 研究目的与意义

2 聚磷菌的筛选与鉴定

2．1 材料

2．1．1 样品来源

2．1．2 药品

2．1．3 仪器

2．1．4 试剂配制

2．2 分析方法

2．2．1 聚磷颗粒(异染粒)染色方法

2．2．2 PHB颗粒染色

2．2．3 磷含量测定方法

2．3 试验方法

2．3．1 聚磷菌的筛选

2．3．2 菌种的鉴定

2．4 结果与分析

2．4．1 聚磷菌筛选结果

2．4．2 聚磷菌鉴定结果

2．5 本章小结

3 好氧／厌氧典型周期聚磷酸盐推动PHB积累的研究

3．1 材料

3．1．1 供试菌株

3．1．2 药品

3．1．3 仪器

3．1．4 培养基

3．2 分析方法

3．2．1 磷含量测定方法

3．2．2 PHB含量测定方法

3．2．3 菌体生物量测定方法

3．3 试验方法

3．3．1 好氧聚磷培养基及培养条件的优化

3．3．2 厌氧培养基营养条件对聚磷酸盐及PHB的影响

3．3．3 好氧／厌氧典型周期聚／释磷及PHB积累的研究

3．4 结果与分析

3．4．1 好氧聚磷培养基及培养条件的优化

3．4．2 厌氧培养基营养条件对聚磷酸盐及PHB的影响

3．4．3 好氧／厌氧典型周期聚／释磷及PHB积累的研究

3．5 本章小结

4 PHB提取条件的优化研究及定性分析

4．1 材料

4．1．1 供试菌体

4．1．2 药品

4．1．3 仪器

4．1．4 培养基

4．2 分析方法

4．2．1 PHB含量测定方法

4．2．2 PHB提取方法

4．3 试验方法

4．3．1 预处理方法对PHB产率的影响

4．3．2 PHB提取条件正交优化试验

4．3．3 聚磷菌透射电子显微镜观察

4．3．4 红外光谱分析

4．4 结果与分析

4．4．1 预处理方法对PHB产率的影响

4．4．2 PHB提取条件正交优化试验

4．4．3 聚磷菌透射电子显微镜观察结果

4．4．4 红外光谱分析结果

4．5 本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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