津田芜菁BrF3H表达特性与启动子活性鉴定

摘要

黄烷酮3-羟化酶(F3H)是高等植物花青素生物合成早期阶段的重要催化酶,F3H基因表达量的增加或减少都可能导致花色产生变异。目前的研究已发现光可以诱导依光型花青素合成的津田芜菁(Tunip‘Tusda’)根皮中花青素的合成以及F3H基因的表达。为了研究津田芜菁中F3H的光诱导表达特性及其转录调控机理,本论文以依光型花青素合成的津田芜菁为试验材料,克隆了BrF3H5’非翻译区包括ORF区的基因片段,并对BrF3H拷贝数和表达特性进行了分析。通过对BrF3H启动子区序列进行生物信息学分析,并转化津田芜菁幼苗和烟草叶片对启动子进行缺失分析,检测报告基因的表达活性,得到了以下主要结果:
　　 1津田芜菁F3H的表达受UV-A诱导
　　 从津田芜菁中克隆了BrF3H5’非翻译区包括ORF区的基因片段,Blast分析表明其ORF区序列与Brassica rapa subsp.pekinensis clone KBrS001M03的部分序列相似性达92％。Southern杂交结果表明,津田芜菁中F3H属于多基因家族。津田芜菁F3H在UV-A诱导下的表达特性说明,UV-A能够诱导BrF3H的表达,且在幼苗下胚轴的中间部位受诱导表达最明显,推测在该部位存在光特异诱导花青素合成的调控途径。
　　 2津田芜菁F3H启动子活性的缺失分析
　　 生物信息学分析表明津田芜菁BrF3H启动子-1091～1 bp的序列除了含有真核生物启动子结构普遍具有的保守序列CAAT box和TATA box外,还含有与光诱导相关的保守序列AE-box、Box-I、CATT-motif、G-Box、GT1-motif、LAMP-element、TCT-motif和chs-Unit1。为确定响应光诱导的启动子区段,将BrF3H启动子进行5’端系列缺失,并与pCAMBIA1301表达载体上的GUS进行融合,构建成pCAM-BrF3Hp1091、pCAM-BrF3Hp724(-1091～-725 bp缺失)、pCAM-BrF3Hp231(-1091～-232 bp缺失)、pCAM-BrF3Hp158(-1091～159 bp缺失)启动子缺失体。通过真空渗透法将含有启动子缺失体的农杆菌转染津田芜菁幼苗进行瞬时表达,GUS组织化学检测结果表明各启动子缺失片段都具有启动子活性。为进一步对BrF3H启动子各缺失体的启动子活性进行定量分析,通过农杆菌介导将各启动子缺失体转化烟草。实时荧光定量PCR技术检测发现已经获得T0代转基因烟草,15个转基因烟草株系中有10个株系为单拷贝,有3个株系拷贝数为2,1个株系拷贝数为3,1个株系拷贝数为4。GUS组织化学检测结果同样表明,各启动子缺失片段均能驱动GUS在烟草叶片和叶柄中表达。在单拷贝插入的转基因烟草中通过定量检测GUS酶活性,表明BrF3H的四个启动子缺失片段都能在烟草中启动GUS的表达,其中以BrF3Hp1091的启动活性最高,启动子BrF3Hp724、启动子BrF3Hp231活性分别是启动子BrF3Hp1091活性的69.2％和35.2％,而启动子BrF3Hp158的活性接近BrF3Hp1091。因此认为,BrF3H启动子-1091～-725 bp、-724～-232 bp的DNA片段缺失导致启动子活性逐渐降低,可能由于该缺失片段中存在促进基因表达的正调控元件;而-231～-158 bp之间DNA片段缺失反而导致启动子活性增加,说明该缺失区域可能存在抑制基因表达的负调控元件;最小启动区域为-158～-1 bp的DNA片段,推测该片段可能是启动子核心部分。