具细菌漆酶活性的芽孢外壁蛋白CotA基因克隆及异源表达研究

摘要

本文从五常林区和凉水国家级自然保护区的森林土壤中筛选出一株具有高漆酶活性的细菌菌株,通过形态学特征、生理生化特性及16S rDNA分析,鉴定该细菌属于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis,定名为Bacillus subtilis WD23。该菌株的产芽孢率与其细菌漆酶酶活成正相关,说明该芽孢杆菌的外壁蛋白具有漆酶活性,可能来源于芽孢外壁组成蛋白CotA。使用B.subtilis WD23芽孢对偶氮和葸醌类染料进行脱色试验,在24 h内脱色率能达到50～90％,用其固定化的芽孢处理造纸黑液,处理7 d色度下降24.9％,COD下降31.2％。利用GenBank上公布的B.subtilis CotA基因序列设计上、下游引物,克隆B.subtilis WD23的CotA基因,并转化Escherich coli BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导其CotA蛋白表达,分子量约为65 kDa,测定工程菌株发酵液的粗提液的漆酶活性达到1700U/mL,表明该菌株漆酶活性来源于其芽孢外衣蛋白CotA。采用特异的His标签纯化试剂盒对CotA蛋白进行纯化。CotA漆酶对RBBR和刚果红的脱色率在87％以上,对靛红和结晶紫的脱色率也达55％以上。本文的主要研究内容和结果如下:
　　 (1)利用铜离子作为筛选剂,从凉水国家级自然保护区的土壤中筛选出一株具有高漆酶活性的菌株。其菌落在含0.2 mmol/LCu2+的培养基上呈灰白色而在不含Cu2+的培养基上呈浅红色。该菌株革兰氏染色反应呈阳性,菌体为短杆状,1～21μm长,能形成芽孢,具有鞭毛和运动性,不能利用木糖和阿拉伯糖这两种典型的枯草芽孢杆菌能利用的碳源。
　　 该菌株的16S rDNA片段长度为1513 bp,在GenBank中的登录序号为EU780682。由构建的系统发育树分析,该菌株与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis的同源性为100％。综合其形态学特征、生理生化特征及16S rDNA分析,鉴定该细菌属于Bacillussubtilis,将此菌株定名为Bacillus subtilis WD23。
　　 (2)通过对B.subtilis WD23的生物学特性研究,得出其最适生长温度是30℃,最适生长pH为7.0,具有一定的抗盐、抗铜、抗紫外线和抗H2O2的能力。
　　 (3)以丁香醛连氮作为底物,测定菌株WD23细菌芽孢漆酶的最适反应温度为60℃,最适反应pH为6.8。B.subtilis WD23芽孢漆酶具有很好的热稳定性及pH稳定性,在80℃高温下,其活性半衰期为2.5 h,在pH9.0,60℃的条件下,其活性半衰期达10d。EDTA、甲醇和Zn2+等化学物质都强烈抑制细菌芽孢漆酶的活性,而Cu2+、Fe2+和Mg2+却可以增强细菌芽孢漆酶的活性。B.subtilis WD23的芽孢漆酶在24 h之内使RBBR和茜素红脱色率达90％以上,刚果红、甲基橙和结晶紫的脱色率也达50％以上,显示了本研究所采用的细菌芽孢漆酶在染料降解上具有很大的应用潜力。
　　 (4)固定化芽孢漆酶最适反应温度为70℃。最适反应pH为6.8。固定化芽孢漆酶贮存于30℃,pH6.8的封闭容器内,其活性半衰期t1/2超过7个月。固定酶的米氏常数Km较非固定化酶的米氏常数Km小。
　　 (5)采用固定式填充床装置,利用固定化微胶囊处理造纸黑液,固定化菌株WD23的芽孢漆酶处理黑液的COD去除率为31.19％,固定化真菌新月弯胞霉处理黑液的COD去除率45.86％,二者联合处理黑液的COD去除率却能达到为61.31％,说明共代谢作用更有利于处理像造纸黑液这样的难处理的复杂污染废水。
　　 (6)以B.subtilis WD23总DNA为模板,扩增得到1558 bp CotA基因,通过BLAST比对,其与枯草芽孢杆菌的CotA基因同源性很高,达到99％,可见克隆的序列为CotA基因。
　　 (7)构建重组表达载体pET22b/CotA,测序得到CotA基因序列共有1542 bp,在GenBank数据库中的登陆号为GQ184294,其氨基酸序列在GenBank数据库中的登陆号为ACS44284。用阳性重组子的质粒转化表达菌株E.coli BL21(DE3),得到了CotA基因的异源表达菌株。
　　 用IPTG诱导CotA基因表达,经SDS-PAGE检测到表达的CotA蛋白在粗提液中,用丁香醛连氮作底物,测定粗提液的漆酶活性达到1700 U/mL,表明菌株WD23的漆酶活性来源其芽孢CotA蛋白。为了提高漆酶的产量,优化了漆酶诱导表达条件,结果表明:诱导剂IPTG的浓度为1.0 mmol/L,加入IPTG时菌液的OD600值为1.0,诱导温度为25℃和诱导时间为15 h漆酶的产量最高。
　　 (8)利用BioEdit软件对CotA氨基酸的亲疏水性进行分析,其亲水性比较强的,表明其易于表达。
　　 利用BLAST软件对B.subtilis WD23的CotA蛋白的保守结构分析,其含有铜氧化酶超家族。用Clust X软件将B.subtilis WD23的CotA氨基酸序列与一些典型的细菌和真菌漆酶进行比对,结果表明其与真菌的漆酶氨基酸序列之间的相似度非常低,而与细菌漆酶如E.coli cueO、嗜热栖热菌、薰衣草链霉菌和抗生素链霉菌的漆酶之间的相似度也比较低,但与IGSK A(B.subalis CotA)的同源性很高。
　　 (9)采用特异的His标签纯化试剂盒对CotA蛋白进行纯化的效果比较好,经Native-PAGE,纯化的CotA蛋白在pH5.0条件下被0.1％丁香醛连氮染成红色。
　　 以丁香醛连氮为底物测定CotA漆酶的最适反应温度为45℃,最适反应pH为7.2。pH7.2条件下,80℃时CotA漆酶活性半衰期t1/2为0.5 h。在最适反应温度45℃下,pH9.0时CotA漆酶活性半衰期t1/2达到8 h。
　　 CotA蛋白的:Km值小于芽孢漆酶的Km值。CotA漆酶对RBBR和刚果红的脱色率在87％以上,对靛红和结晶紫的脱色率也达55％以上,此CotA漆酶在短时间内对染料能够有效地脱色,能够成为有潜力的工业用酶。