柽柳ThDREB和TheIF1A基因抗逆功能研究

摘要

在植物基因工程育种中,与导入一个功能基因相比,导入一个关键的调控基因的改良效果更好。而基因的表达调控是在多级水平上参加的复杂事件,其中转录起始是基因表达的最有效的调节环节,翻译以及翻译后加工是基因表达的基本控制点。因此本研究以刚毛柽柳(Tamarix hispida)的转录因子ThDREB和翻译起始因子TheIF1A两个基因为研究对象,对基因的表达和功能进行了初步研究,以期为抗逆基因工程育种提供理论依据和基因材料。主要研究结论如下:
　　 (1)利用实时定量RT-PCR技术,对不同胁迫条件下ThDREB和TheIF1A基因在柽柳中的时序表达进行了分析。结果表明,ThDREB和TheIF1A基因均能够对NaCl、PEG、NaHCO3以及CdCl2胁迫做出应答反应,并且在不同胁迫条件下基因的表达模式各不相同,具有一定的组织器官表达特异性。
　　 (2)采用基因枪瞬时转化技术,分别将ThDREB-GFP和 ThelF1A-GFP融合蛋白转化到洋葱表皮细胞使其瞬时表达,结果均在细胞核发出绿色荧光,表明 ThDREB和TheIF1A蛋白的表达均定位于细胞核中。
　　 (3)将ThDREB和TheIF1A分别构建到酵母表达载体pYES2中,重组质粒pYES2-ThDREB和pYES2-TheIF1A转化酿酒酵母INVScl,比较重组和非重组酵母在盐(NaCl、KCl和MgCl2)、重金属(ZnCl2、CuSO4和CdCl2)、氧化(H2O2)、渗透(山梨醇)、碱(Na2CO3)、冷(-20℃)和热(53℃)胁迫下的生长状况,验证这ThDREB和TheIF1A基因对不同非生物胁迫的抵抗性。结果表明ThDREB和TheIF1A基因对包括盐、盐碱、干旱、过氧化物、重金属、冷和热在内的多种非生物胁迫均具有良好的抵抗能力。
　　 (4)将ThDREB和TheIF1A分别构建到植物表达载体pROKⅡ质粒上,采用根癌农杆菌介导法进行烟草的遗传转化,分别获得16和20株卡那霉素抗性芽,PCR检测表明基因均整合到烟草基因组中。对各转基因烟草子代分别进行盐(0,100,150mmol/LNaCl)、旱(0,350mmol/L Mannitol)胁迫处理,比较各株系的发芽率和鲜重,从而分析转基因烟草的耐盐抗旱能力。
　　 结果表明在不同浓度NaCl胁迫下,转基因株系的发芽率均高于非转基因株系,并且随着NaCl浓度的增加,非转基因烟草的发芽率明显受到抑制,而转基因株系发芽率抑制相对较弱,具有较强的耐盐特性；长期盐(250mmol/L NaCl)、旱(0,150,250,350mml/L Mannitol)胁迫处理实验结果表明转基因株系的鲜重、根长和地上部分高均优于非转基因株系。在干旱胁迫/渗透胁迫(Mannitol)条件下,转基因株系的发芽率和鲜重均明显高于非转基因株系,随着Mannitol浓度的增加,非转基因株系生长明显受到抑制,而转基因烟草鲜重、根长和地上部分高的增加显著高于对照,其中转基因株系D-15和1A-3耐盐抗旱性表现最为突出。
　　 以上结果表明ThDREB和TheIF1A基因均能在不同程度提高植物对盐、旱的耐受能力。
　　 (5)利用基因组步移技术,克隆得到长度为1352bp的TheIF1A启动子PTheIF1A。序列分析表明,该启动子区域包含多种与逆境响应相关的顺式作用元件,如HSE、MBS、TGACG—motif、TC-rich repeats和W-box等。将启动子PTheIF1A构建到pCAMBIA1301中,驱动GUS基因表达。采用根癌农杆菌介导瞬时转化法转化烟草,染色结果显示转化的烟草叶片有蓝色斑点,说明启动子PTheIF1A具有启动GUS表达的活性。采用农杆菌介导的浸花法转化拟南芥,通过对拟南芥种子的潮霉素抗性筛选获得转化拟南芥植株,经X-gluc染色结果表明,启动子PTheIF1A驱动的GUS主要在拟南芥的根部和叶片中表达,在茎中表达量较少。