2种基因分型方法进行野鸟源AIV HA亚型鉴定的应用研究

摘要

禽流感是一种禽类高度接触性传染病。不仅严重危害家禽养殖业，也对人类的生命和健康造成威胁。野生鸟类是禽流感病毒的重要宿主，研究野生鸟类携带病毒的情况，对于了解野鸟在禽流感传播的作用，进而防控禽流感的爆发具有重要意义。因此，准确、方便快捷的禽流感病毒亚型鉴定方法对于野鸟流感病毒感染与流行状况的调查监测是十分必要的。
　　 本研究参照L.P. Phipps等人建立的通用引物RT-PCR HA亚型鉴定方法和KenjiTsukamoto等人设计的针对各个HA亚型的简并引物的HA亚型分型方法，对已知亚型的部分流感病毒毒株以及新采集未做鉴定的部分毒株进行HA亚型分型实验。将所有病毒样品进行RT-PCR扩增，PCR产物经回收纯化后连接到pMD18-T载体上，将连接产物转入DH5a感受态细胞中，将PCR鉴定为阳性的重组质粒进行测序，将测得的核苷酸序列结果与GenBank上公布的参考毒株序列进行同源性比较，以确定其HA亚型。
　　 BLAST比对结果显示，简并引物和通用引物均能较好较准确的对禽流感病毒毒株进行HA亚型的分型，但在实际操作以及方便快捷的方面来比较，利用通用引物进行HA亚型的分型更为优越，更为简便易行。通过验证，利用通用引物进行HA亚型分型的方法更适合于野鸟流感病毒的亚型鉴定。
　　 为了确实的证明通用引物的适用性，我们又在上述实验的基础上做了一些补充验证性实验，包括对用通用引物分完亚型的毒株，利用简并引物再次鉴定、对于新采集鉴定为AIV阳性的毒株利用通用引物进行PCR扩增以及实际证明利用小片段进行BLAST比对分型结果具有可行性等。从多方面实际验证了该方法的适用性和可行性，进而为本实验室今后野鸟流感病毒亚型鉴定提供了一种有效、方便的方法。