RGV胁迫下东北林蛙组织中NF-kB及血液相关细胞因子表达变化

摘要

两栖类在长期进化过程中，形成了应对多种微生物侵袭的免疫防御体系。核转录因子κB(NF-κB)是参与机体先天免疫的一类重要模式分子。研究该分子在病原微生物胁迫下的动态表达及其相关细胞因子的表达变化对两栖类免疫学的研究具有重要意义。
　　方法:本研究选取东北地区两栖类的代表物种东北林蛙(Rana dybowskii)为研究对象，以蛙类易感的蛙虹彩病毒(Rana grylio virus，RGV)为病原微生物，腹腔注射感染健康成年东北林蛙。选取注射RGV后0.5、1、2、4、8、12、16、24、48和72h的东北林蛙皮肤、肝脏、脾脏和血液组织作为实验材料，根据本实验室高通量测序结果，设计NF-κB1、NF-κB2、I-κB、TNF-α、VCAM、SOD和iNOS引物，利用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR技术，检测NF-κ B1、NF-κB2、I-κB、TNF-α、VCAM、SOD和iNOS分子mRNA在各观测时间点的表达水平，分析动态表达变化。
　　实验结果:RGV胁迫后东北林蛙皮肤、肝、脾组织中NF-κ B1、NF-κ B2和I-κB分子mRNA的表达量呈规律变化，从胁迫后的0.5h，NF-κ B1和NF-κ B2 mRNA在三个组织中都呈上调趋势，分别在刺激后2h（肝脏）和4h（皮肤）快速上调至峰值;在脾脏中NF-κ B1和NF-κB2上调趋势缓慢，分别在16h(NF-κ B2)和24h(NF-κB1)达到峰值，三个组织中NF-κ B1的表达量均高于NF-κ B2。NF-κ B1和NF-κ B2表达至峰值后开始下调，并在8h（肝脏）和12h（皮肤）下调至初始水平，在脾脏中NF-κ B1和NF-κB272h才达到初始水平。I-κB在受刺激初期表达量也立即下调，其上调时间点与NF-κ B的上调时间点基本相同，且I-κB的表达量高于NF-κ B1和NFκ B2。实验组与对照组之间存在显著差异(P＜0.05)。
　　以注射RGV的东北林蛙为实验组，同时给予NF-κB抑制剂的东北林蛙为对照组，检测血液中相关细胞因子TNF-α、VCAM、SOD和iNOS mRNA的表达变化。结果表明，与对照组相比实验组各基因表达量显著增加。TNF-α在胁迫48h表达量增加最显著，是对照组的5倍;VCAM个时间点均显著增加，其中2h表达量为对照组的60倍，96h恢复到正常水平;SOD在个试验点表达量均增加明显，最高可达对照组的100倍;iNOS在受RGV胁迫后1h、2h、12h、48h增加显著。实验组与对照组之间存在显著差异(P＜0.05)。
　　结论:在RGV胁迫下，东北林蛙NF-κB分子表达量呈现先降低(胁迫后0-0.5h)、再升高(0.5-4h)、再降低(4-72h)的变化趋势，I-κB表达趋势与NF-κ B基本相同，表达量上调时间点落后于NF-κ B，证明RGV胁迫下东北林蛙NF-κB信号通路被激活;与NF-κB抑制剂组相比，实验组各免疫因子表达量显著增高，证明NF-κB分子可调节TNF-α、VCAM、SOD和iNOS的转录、翻译过程，从而参与东北林蛙的免疫防御反应。

目录

摘要

缩略语表

1 绪论

1．1 东北林蛙

1．2 虹彩病毒

1．2．1 虹彩病毒分类

1．2．2 虹彩病毒对两栖类的威胁

1．2．3 虹彩病毒的传播方式

1．3 NF-κB研究进展

1．3．1 NF-κB/Rel、Ⅰ-κB、IKK的结构和组成

1．3．2 哺乳动物NF-κB信号途径

1．3．3 果蝇NF-κB信号途径

1．3．4 NF-κB与免疫应答

1．3．5 两栖类NF-κB的研究进展

1．3．6 本研究的目的意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 试验动物及毒株

2．1．2 主要仪器

2．1．3 主要试剂

2．1．4 试剂的配制

2．2 方法

2．2．1 引物设计

2．2．2 虹彩病毒液制备及接种

2．2．3 样品组织采集

2．2．4 组织总RNA提取

2．2．5 总RNA纯度及完整性检测

2．2．6 目的基因克隆、测序

2．2．7 标准曲线的制备

2．2．8 荧光定量PCR

2．2．9 定量PCR的数据处理

3 结果与讨论

3．1 虹彩病毒感染

3．2 总RNA质量检测

3．3 目的基因PCR反应结果

3．4 目的基因克隆、筛选及测序结果

3．5 标准曲线

3．6 目的基因荧光定量PCR结果

3．7 讨论

结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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