EGCG棕榈酸酯抗PRRSV活性研究

摘要

表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)作为茶叶中最重要的活性组分，具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒等多种生理活性。但由于脂溶性差、体内不稳定和生物利用度低等问题使其应用受到了限制。为提高EGCG的稳定性和生物利用度，本文开展了棕榈酰化EGCG衍生物的合成及抗病毒活性方面的研究工作，具体内容如下:
　　通过已知工艺条件合成棕榈酰化EGCG(EGCGP)，经过稀酸、稀碱洗涤干燥，再对制备的初产物进行柱层析纯化得到，并通过UV、IR、MS确证结构:在280nm处出现较强的紫外特征吸收峰;在1703cm-1处有一非共轭饱和脂肪酯的红外特征峰，质谱分子离子峰m/z695.4。
　　EGCGP在人工模拟猪体内胃肠道环境中的稳定性考察结果表明，EGCGP的稳定性比EGCG好，EGCG和EGCGP的稳定性随模拟胃液pH值的升高而增加。EGCG和EGCGP初始浓度均为5.00mmol/L，在pH=2.0的人工模拟猪胃液中，4h后EGCG和EGCGP最终保留浓度分别为2.01mmol/L、3.42mmol/L，其含量分别下降了59.82％、31.60％;在pH=3.5的人工模拟猪胃液中，4h后EGCG和EGCGP最终保留浓度分别为3.09mmol/L、3.91mmol/L，其含量分别下降了38.24％、21.80％。在人工模拟猪肠液中，5h后EGCG和EGCGP最终保留浓度分别为3.25mmol/L、3.85mmol/L，其含量分别下降了33.86％、23.06％。
　　EGCGP在大鼠体内相对生物利用度的研究表明，EGCGP的生物利用度比EGCG高，EGCGP相对生物利用度比EGCG提高24.3％。
　　EGCGP抗PRRSV活性研究表明，EGCG、EGCGP和病毒唑的半数细胞致死浓度(CC50)分别为2359.71μM，431.42μM和94.06μM，EGCGP比EGCG的细胞毒性大。EGCGP对PRRSV感染MARC-145细胞的阻断、抑制和直接杀灭作用均呈剂量依赖性，且阻断作用比抑制和直接杀灭作用强。EGCG、EGCGP、病毒唑阻断PRRSV感染作用的半数有效抑制浓度(EC50)分别为10TCID50∶8.53μM、0.48μM、0.40μ M;100TCID50∶60.25μM、5.53μM、3.48μM;选择性指数(SI)分别为10TCID50∶276.62、892.29、234.98;100TCID50∶39.16、77.96、27.02。
　　以EGCG为先导化化合物，通过结构修饰制备具有抗PRRSV活性的EGCG棕榈酰化衍生物，以改善脂溶性，提高生物利用度，可为进一步开发抗PRRSV药物提供技术支撑。

目录

摘要

1 绪论

1．1 猪繁殖与呼吸综合征病毒综述

1．1．1 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的发现

1．1．2 PRRSV的病原学特征

1．1．3 PRRSV的免疫学特征

1．1．4 PRRSV的流行病学特征

1．1．5 PRRSV的临床症状

1．1．6 PRRS的发病机制

1．1．7 PRRS的预防与控制

1．2 EGCG文献综述

1．2．1 EGCG分子式及结构式

1．2．2 EGCG的理化性质

1．2．3 EGCG生物活性

1．3 EGCG结构修饰研究现状

1．3．1 脂溶性修饰

1．3．2 水溶性修饰

1．4 EGCG及其衍生物的抗病毒研究进展

1．4．1 抗流感病毒

1．4．2 抗人类免疫缺陷病毒

1．4．3 抗EB病毒

1．4．4 抗腺病毒

1．4．5 抗肝炎病毒

1．5 立题背景与研究意义

1．6 主要研究内容与实验设计

1．6．1 主要研究内容

1．6．2 实验设计

2 EGCG棕榈酸酯的合成与纯化

2．1 引言

2．2 实验仪器与材料

2．2．1 实验材料与试剂

2．2．2 实验仪器

2．3 实验步骤

2．3．1 EGCG棕榈酸酯的合成工艺示意图

2．3．2 EGCG棕榈酸酯的合成

2．3．3 EGCG棕榈酸酯的纯化

2．3．4 EGCG棕榈酸酯的鉴定

2．4 结果与讨论

2．4．1 紫外光谱分析

2．4．2 红外光谱分析

2．4．3 质谱分析

2．5 本章小结

3 EGCG棕榈酸酯的稳定性和生物利用度研究

3．1 稳定性

3．1．1 实验材料与试剂

3．1．2 实验仪器

3．1．3 实验方法

3．2 生物利用度

3．2．1 实验材料与试剂

3．2．2 实验仪器

3．2．3 实验方法

3．3 结果与讨论

3．3．1 稳定性

3．3．2 生物利用度

3．4 本章小结

4 EGCG棕榈酸酯体外抗PRRSV感染的研究

4．1 实验仪器与材料

4．1．1 实验材料与试剂

4．1．2 实验仪器

4．1．3 主要溶液配制

4．1．4 细胞培养的准备工作

4．2 实验方法与步骤

4．2．1 细胞的复苏

4．2．2 细胞的传代培养

4．2．3 细胞的冻存

4．2．4 MTT法测定EGCG、EGCGP以及病毒唑对细胞抑制作用

4．2．5 病毒传代

4．2．6 病毒毒力(TCID50)测定

4．2．7 EGCG、EGCGP以及病毒唑抗PRRSV作用

4．3 结果与讨论

4．3．1 试验化合物对细胞的抑制作用

4．3．2 PRRSV TCID50的测定

4．3．3 EGCG、EGCGP以及病毒唑对PRRSV的阻断作用

4．3．4 EGCG、EGCGP以及病毒唑对PRRSV的抑制作用

4．3．5 EGCG、EGCGP以及病毒唑对PRRSV的直接杀灭作用

4．4 本章小结

结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

声明