水曲柳种子脱水耐性蛋白质组和转录组学研究

摘要

脱水耐性是正常型种子完成体内水分相对适度平衡的一种能力。是在储藏或环境胁迫中能够存活、保证物种更好繁衍的一种适应性策略。在低温和干旱胁迫条件下，理解正常型种子如何对脱水的反应是提高种子质量和种子长期保存的前提条件。不同类型的种子脱水敏感性不尽相同，它直接影响到种子的储藏和种质资源的保存，因而种子脱水耐性的研究在理论和实践上都具有重要的意义。种子脱水耐性问题一直是种子生理学研究中比较热门的问题，但到目前为止对种子脱水耐性的分子调控机制的研究还处于探索阶段。本研究以东北地区重要阔叶用材树种水曲柳的种子为试验材料，利用水曲柳已解除休眠种子的再干燥脱水过程来研究种子脱水耐性的分子机制，采用分子生物学中蛋白质组学和转录组学的试验技术，研究筛选在不同条件下（20℃;20℃硅胶处理;1℃;1℃用Ca2+处理）相对含水量为10％时种子的差异蛋白。不同条件下提取脱水的种子蛋白，通过2D-DIGE技术分离蛋白质，然后通过质谱进行鉴定。在凝胶上总共发现2919个蛋白点，具有显著性差异的蛋白点为27个，使用MALDI TOF/TOF质谱仪成功鉴定出7个差异蛋白，其中6个蛋白是上调，1个蛋白是下调。特别是驱动蛋白-1在低温胁迫下表现为上调，驱动蛋白-1除了在拟南芥中被发现外，很少在植物中被发现，这个蛋白与微管运动的有关，影响和调控动态生长及微管的聚集，同时提供微管和其它细胞间的结构连接，对调控微管的冷稳定性起到了很重要的作用。
　　在种子发育过程中，脱水耐性被严格的控制，可是在正常型种子中确定种子的脱水耐性很难达到一个统一的机制。原因是种子对水分缺失的反应相当复杂。因此，从分子角度上应当分析和比较与脱水耐性相关的基因。转录调控是通过转录因子和特殊元件相互作用来进行调解的，而新一代测序技术的应用能够确定基因序列和转录本，甚至在没有参考基因的情况下允许基因表达模式的大量分析。
　　我们在水曲柳种子中获得了大约8千万个reads，从头组装产生了52，992个高质量的unigenes序列，平均长度为383 bp。其中44，251 unigenes被成功注释到公共蛋白数据库中，其中218和脱水耐性相关。在三个不同处理的样本中分析鉴定出显著差异的1，231个转录本。在每个处理中根据功能对unigene进行了分类，这些数据对水曲柳种子将来进一步的研究提供了丰富的数据来源。最后，我们预测到了1，683个单核苷酸多态性(SNP)，其中在20℃和1℃两个处理之间显示出649个多态性位点，在1℃和1℃钙处理两个样本之间显示出1034个多态性位点。本试验中，我们使用了Solexa技术平台建立了水曲柳种子不同处理条件下转录组。
　　从水曲柳转录组中我们鉴定了包括Zinc finger、NAC、Cytochrome P450、Protease、WRKY、MYB、bZIP、ERF、Lipase、AP2/ERF、ARF、RINGfinger、CIPK、DREB、bHLH、Pathogen-related protein、MADS-box等17转录因子家族。我们发现20℃、1℃和钙处理1℃的水曲柳种子三个样本之间转录因子家族中许多基因的表达发生不同程度的变化，说明多种转录因子家族共同参与了水曲柳的脱水和低温下胁迫的应答反应。表达谱分析结果显示，在各转录因子家族中，Zinc finger基因家族的胁迫应答基因数量最多，其次是Protease、NAC、ERF、bZIP、Cytochrome P450、MYB基因家族。对NAC、WRKY、MYB家族基因聚类分析发现，多数基因的表达受低温脱水胁迫诱导，NAC、WRKY、MYB家族中钙处理后的基因表达模式表现为上调，说明钙在低温脱水应答中发挥了重要的作用。其它处理中表达模式并不相同，说明同一个转录因子家族不同成员有可能参与了水曲柳对低温脱水耐性响应的调控，或者在相同处理应答中发挥不同的作用。通过进一步分析表明，本试验显著富集的几个通路中涉及到分子伴侣和折叠催化（chaperones and folding catalysts），MAPK信号通路(mitogen-activated protein kinase signaling pathway)和在内质网中蛋白加工(protein processing in endoplasmic reticulum)，这几个通路在基因表达水平上被严格调控。
　　此外，本研究提供了水曲柳种子在不同条件下再脱水反应中转录组的有效数据并作为进一步研究的基础。本研究旨在探索不同脱水条件下正常型种子脱水耐性变化的内在分子机制，为进一步研究种子脱水耐性的蛋白质组学和基因组学奠定基础。研究结果对丰富种子脱水耐性理论和指导农林业种子生产实践都有重要意义。

目录

摘要

1 绪论

1．1 课题背景(或引言)

1．2 植物脱水耐性机理研究

1．2．1 种子的脱水耐性研究策略

1．3 植物脱水耐性研究进展

1．4 蛋白质组学在脱水耐性中的应用

1．4．1 蛋白质相互作用的研究

1．4．2 差异蛋白质组学的研究

1．5 转录组学研究方法

1．5．1 基因芯片技术的研究

1．5．2 Sanger测序法的基因表达系列分析

1．5．3 新一代高通量测序技术的转录组测序

1．6 植物脱水耐性转录组学研究进展

1．6．1 在复苏性植物中的转录组比较分析

1．6．2 水分缺失引发的转录调控

1．7 研究的目的和意义

1．8 研究的内容和技术路线

2 水曲柳种子脱水耐性差异表达蛋白的分析

2．1 材料与方法

2．1．1 试验材料

2．1．2 试验仪器与试验试剂

2．1．3 试验方法

2．2 结果与分析

2．2．1 水曲柳种子蛋白的提取和定量

2．2．2 水曲柳种子蛋白的双向电泳分析

2．2．3 水曲柳种子不同处理条件下差异表达蛋白的分离

2．2．4 水曲柳种子不同处理条件下差异表达蛋白的鉴定

2．2．5 水曲柳种子不同处理条件下差异表达蛋白的功能分析

2．3 讨论

2．4 本章小结

3 水曲柳种子脱水耐性转录组分析

3．1 试验材料

3．1．1 试验材料

3．1．2 试剂

3．2 试验方法

3．2．1 水曲柳种子总RNA的提取

3．2．2 Solexa测序

3．2．3 转录组测序产量统计及De novo组装

3．2．4 基因功能注释

3．2．5 基因表达量注释

3．2．6 差异表达基因GO和KEGG富集分析

3．2．7 水曲柳种子低温脱水胁迫下基因表达谱的构建

3．3 结果与分析

3．3．1 RNA质量检测

3．3．2 测序产量和组装质量统计

3．3．3 基因功能注释

3．3．4 Unigene高丰度表达基因分析

3．3．5 差异表达基因的筛选

3．3．6 差异表达基因的GO功能分类

3．3．7 差异表达基因的Cluster聚类和功能富集分析

3．3．8 低温和脱水胁迫应答相关转录因子的鉴定

3．3．9 低温和脱水胁迫下代谢路径

3．3．10 低温和脱水胁迫下应答相关基因分析

3．4 讨论

3．5 本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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