南瓜SSR反应体系的优化及南瓜无蔓性状分子标记研究

摘要

南瓜（Cucurbitaceae）是人类历史上种植较古老的作物之一，在中国有悠久的栽培历史，分布广泛，被称为世界蔬菜。南瓜具有抗逆性强，品种资源丰富，适应性强，用途广，耐贮存，产量高，果实形状、大小、颜色、品质各有不同，具有显著的生物多样性特征。同时南瓜又有很高的营养价值和药用价值。南瓜的营养物质组成全面而又独具特色，特别是南瓜果肉中VA含量居所有瓜菜之首。然而，目前国内外对南瓜作物的研究远远落后于其他作物，可应用于南瓜的分子标记数量非常有限。本研究在对南瓜SSR-PCR技术体系优化的基础上，对影响南瓜产量的蔓性性状进行了分子方面研究，旨在为南瓜控制蔓性性状基因的精细定位以及对标记的蔓性基因进行基因克隆提供科学依据。
　　主要研究结果如下:
　　1.为获得高质量的南瓜基因组DNA，通过对传统的CTAB法进行改良，得出调整后的CTAB法:每25ml CTAB抽提缓冲液中加入0.25g PVP和1ul巯基乙醇，并用TE溶液(内含1ul的10mg/ml的RNaseA)溶解南瓜基因组DNA。可有效减少南瓜叶中的酚类物质、蛋白、多糖和RNA，为后续的PCR反应提供高质量的基因组DNA。
　　2.为获得有效的南瓜SSR-PCR反应体系，以南瓜无蔓突变体自交系和长蔓自交系为试验材料，借鉴了前人对其他植物分子标记的成功经验，通过采用正交试验的方法对影响南瓜SSR反应体系中的主要条件进行研究，并设计了梯度PCR退火温度对南瓜SSR反应体系进行优化，建立了最佳的SSR-PCR反应体系。反应体系为20μl，含有1.5mmol/L Mg2+,60ng DNA,0.20mmol/L dNTPs,0.25mmol/L Primer和1.5U Taq酶，梯度PCR试验筛选引物，得到最佳退火温度为44.1℃。
　　3.利用筛选出的36对特异性引物对24份亲本材料共扩增出2437条带，其中2329条表现多态性，占总数的95.57％。不同引物扩增产物总带数和获得的多态性带数差异比较大，扩增产物条带从2条到8条不等，平均4条。多态性位点百分率最高为100％，最低为35％。
　　4.利用SSR标记技术对南瓜长蔓自交系和无蔓自交系的F2代分离群体进行遗传分析，测得纯合无蔓群体与杂合无蔓群体遗传距离为7.2693cM，纯合无蔓群体与长蔓群体遗传距离为10.1426cM，杂合无蔓群体与长蔓群体遗传距离为8.0847cM。求出LOD值大于3时有5个标记可以有效连锁。供试材料相似系数在阀值为0.63处正好可把F2代群体划分为2个类群。第一类群为无蔓性状南瓜，第二类群为长蔓性状南瓜。第一类群包含了134份无蔓性状群体，第二类包含了24份长蔓性状群体，从而印证了南瓜无蔓性状是由显性基因控制的，南瓜无蔓矮化突变体是由隐性逆转显性突变。

目录

摘要

英文缩略词

1 绪论

1．1 南瓜的研究现状

1．2 南瓜的营养成分和药用价值

1．2．1 南瓜果肉的营养成分

1．2．2 南瓜种子的营养成分

1．2．3 南瓜的药用价值

1．3 南瓜分子标记开发研究

1．3．1 分子标记简介

1．3．2 理想分子标记条件

1．3．3 分子标记分类

1．3．4 SSR标记开发的策略

1．3．5 EST-SSR的应用

1．3．6 遗传多样性

1．3．7 分子标记辅助选择育种

1．4 南瓜无蔓性状的研究

1．4．1 无蔓南瓜的生理特性

1．4．2 无蔓南瓜的栽培优势

1．4．3 无蔓南瓜的研究进展

1．4．4 无蔓南瓜在育种研究中的重大意义

1．4．5 无蔓南瓜研究的发展趋势

1．5 本研究目的及意义

2 南瓜SSR-PCR技术体系的优化

2．1 引言

2．2 实验仪器和药品

2．2．1 实验仪器

2．2．2 主要试验试剂及配制方法

2．3 实验方法

2．3．1 实验材料

2．3．2 引物设计

2．3．3 南瓜基因组DNA的提取

2．3．4 南瓜基因组DNA纯度及浓度检测

2．3．5 PCR反应正交试验

2．3．6 设置退火温度

2．4 结果与分析

2．4．1 检测南瓜基因组DNA

2．4．2 SSR-PCR反应体系优化

2．4．3 优化退火温度

2．5 讨论

2．6 本章小结

3 南瓜无蔓性状的SSR标记研究

3．1．1 引言

3．2 实验方法

3．2．1 实验流程

3．2．2 群体构建

3．2．3 SSR引物特异性筛选

3．2．4 非变性聚丙烯酰胺电泳检测

3．2．5 聚类分析

3．2．6 遗传距离计算

3．3 结果与分析

3．3．1 田间调查

3．3．2 筛选SSR特异性引物

3．3．3 特异性SSR引物检测亲本多态性

3．3．4 部分引物对F2代分离群体扩增产物的凝胶电泳图谱

3．3．5 聚类分析

3．3．6 遗传距离分析

3．4 本章小结

4 结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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