水溶性紫杉醇冻干粉临床前药物初步评价

摘要

紫杉醇已于1992年被美国FDA批准作为抗卵巢癌新药上市，紫杉醇对卵巢癌、乳腺癌、肺癌等多种肿瘤有良好的治疗效果。但是由于其难溶于水，需要溶于聚氧乙烯蓖麻油(cremophor EL)与无水乙醇混合溶媒中增加其水溶性，而聚氧乙烯蓖麻油在体内降解时释放组胺，会引起不同程度的过敏反应，严重者可引起神经细胞内颗粒释放及骨髓鞘改变等不良效果。为降低药物毒性，提高其疗效，近年来各国都在陆续开发紫杉醇的新剂型，本实验室利用紫杉醇、人血白蛋白及甘露醇，通过乳化法制备出水溶性紫杉醇冻干粉，水溶性紫杉醇冻干粉属于紫杉醇微粉类药物，其具有水溶性较好、毒性较低等特点。为了验证水溶性紫杉醇冻干粉的抗肿瘤效果，我们通过以下途径进行了研究:
　　1)用紫杉醇敏感人体肿瘤细胞对水溶性紫杉醇冻干粉进行体外活性检测;
　　2）对S180荷瘤小鼠模型及SKOV-3裸鼠模型进行腹腔注射研究水溶性紫杉醇冻于粉体内抑瘤活性;
　　3)通过尾静脉注射水溶性紫杉醇冻干粉进行急性毒性试验，观察给药后个体行为状态;
　　4）利用Caco-2细胞模型模拟体内吸收，检验水溶性紫杉醇冻干粉能否作为一种口服剂型被开发。
　　1.以紫杉醇原料药为阳性对照，通过MTT比色法研究水溶性紫杉醇冻干粉对紫杉醇敏感肿瘤细胞的抗肿瘤效果，实验结果表明:水溶性紫杉醇冻干粉对人乳腺癌细胞(MCF-7)、人卵巢癌细胞(SKOV-3)、人前列腺癌细胞(PC-3)均有较好的抑制作用，IC50值分别为0.886μM、0.913μM、0.687μM。
　　2.建立鼠肉瘤S180系小鼠移植瘤模型，随机分为6组，通过腹腔注射法给药，分别注射生理盐水、已上市的紫杉醇注射液、ABI-007注射液及3种浓度（高剂量，中剂量，低剂量）的水溶性紫杉醇溶液，经过注射7d后，断颈处死小鼠，解剖称量瘤重。实验结果表明:水溶性紫杉醇低剂量组抑瘤率为52.8％，水溶性紫杉醇中剂量组抑瘤率为54.9％，水溶性紫杉醇高剂量组抑瘤率为81.3％，ABI-007对照组的抑瘤率为71.9％，阳性紫杉醇对照组的抑瘤率81.6％。实验数据表明水溶性紫杉醇冻干粉对小鼠移植性肿瘤S-180的生长有明显的抑瘤作用。
　　3.建立人卵巢癌（SKOV-3）荷瘤裸鼠移植瘤模型，将成长健康的裸鼠随机分为5组，分别为生理盐水组、紫杉醇对照组、ABI-007组、水溶性紫杉醇冻干粉中剂量组、水溶性紫杉醇冻干粉高剂量组，按剂量腹腔注射给药4周。在给药期间对SKOV-3荷瘤裸鼠的体重与瘤体积进行测量，计算瘤重。水溶性紫杉醇中剂量组抑瘤率为54.9％，水溶性紫杉醇高剂量组抑瘤率为65.1％，阳性紫杉醇对照组抑瘤率57.7％，ABI-007对照组的抑瘤率58.1％。实验结果表明:水溶性紫杉醇冻干粉对裸鼠人卵巢癌SKOV-3移植瘤的抑制作用较明显。
　　4.为了研究水溶性紫杉醇冻干粉对小鼠的急性毒性反应本文采用了最大给药量法，在合理的最大给药浓度的前提下，以允许的最大剂量20 mg/kg单次尾静脉注射给药，同时观察给药后昆明小鼠各组的生长状况，实验结果证明:在给药剂量范围内水溶性紫杉醇冻干粉注射剂的毒性很小，安全系数高。
　　5.为了检验水溶性紫杉醇冻干粉能否开发成一种新的口服剂型，本文利用Caco-2细胞模型，对6个浓度（0.5μM、1μM、2μM、5μM、10μM、20μM）下的水溶性紫杉醇冻干粉转运量进行了研究，分别考察了从AP侧（顶侧）→BL侧（基底侧）和BL侧→AP侧的跨膜转运特性，水溶性紫杉醇冻干粉的Papp AP→ BL值为20.9±2.1×10-6 cm/s;N=3。吸收效果好的药物表观渗透系数Papp值大于1.0×10-6 cm/s，说明了水溶性紫杉醇冻干粉具有开发为口服剂型的可能性。
　　综上所述，水溶性紫杉醇冻干粉克服了紫杉醇的水溶性问题，可以直接快速静脉给药，避免了聚氧乙烯蓖麻油的副作用。在体内与体外的活性检测中表现出较好的抗肿瘤效果，同时水溶性紫杉醇冻干粉毒性比常规紫杉醇制剂毒性明显降低，所以具有巨大的研究价值和市场前景。

目录

摘要

1 绪论

1．1 课题背景

1．1．1 恶性肿瘤概述

1．1．2 抗肿瘤药物的分类

1．1．3 抗肿瘤植物药研究发展

1．1．4 红豆杉提取物紫杉醇抗肿瘤活性研究进展

1．1．5 Caco-2细胞模型的应用

1．2 立题依据

2 水溶性紫杉醇冻干粉的制备

2．1 实验试剂与仪器

2．2 水溶性紫杉醇冻干粉的制备方法

2．3 水溶性紫杉醇冻干粉的形貌表征和稳定性评价

2．3．1 水溶性紫杉醇冻干粉的形貌

2．3．2 水溶性紫杉醇冻干粉的存储稳定性

2．4 本章小结

3 水溶性紫杉醇冻干粉体外抗肿瘤活性研究

3．1 实验仪器与材料

3．1．1 仪器与材料

3．1．2 细胞株

3．1．3 主要试剂的配制

3．1．4 细胞的准备

3．2 水溶性紫杉醇冻干粉体外抗肿瘤活性

3．2．1 实验方法与步骤

3．2．2 实验结果与讨论

3．3 讨论

3．4 本章小结

4 水溶性紫杉醇冻干粉体内抗肿瘤活性研究

4．1 实验仪器与材料

4．1．1 实验仪器

4．1．2 实验材料

4．2 实验方法与步骤

4．2．1 实验分组与处理

4．2．2 抑瘤率的测定公式

4．3 实验结果与分析

4．3．1 给药后荷瘤小鼠情况观察

4．3．2 给药前后小鼠体重变化

4．3．3 抑瘤率的计算

4．3．4 肿瘤的形态学观察

4．4 水溶性紫杉醇冻干粉急性毒性试验

4．5 本章小结

5 水溶性紫杉醇冻粉对SKOV-3荷瘤裸鼠的抑瘤作用

5．1 实验仪器与材料

5．1．1 实验仪器

5．1．2 实验材料

5．2 实验方法与步骤

5．2．1 人卵巢癌(SKOV-3)细胞培养

5．2．2 实验动物的饲养

5．2．3 (SKOV-3)荷瘤裸鼠模型的建立

5．2．4 实验分组与处理

5．2．5 抑瘤率的测定公式

5．3 实验结果与分析

5．3．1 裸鼠SKOV-3移植瘤模型的建立

5．3．2 裸鼠给药前后体重变化

5．3．3 抑瘤率的计算

5．4 水溶性紫杉醇冻干粉毒副作用

5．5 本章小结

6 利用Caco-2细胞模型对水溶性紫杉醇冻干粉跨膜吸收转运的研究

6．1 Caco-2单层细胞膜的建立

6．1．1 实验仪器与材料

6．1．2 实验仪器与材料

6．2 实验方法

6．2．1 主要溶液的配制

6．2．2 细胞模型的建立

6．3 Caco-2细胞模型的验证

6．3．1 细胞跨膜电阻的测定

6．3．2 荧光黄(Lucifer yellow CH)透过量测定

6．3．3 细胞形态学的观察

6．4 水溶性紫杉醇冻干粉双向转运实验

6．4．1 药物双向转运实验加药方法

6．4．2 抑制剂对水溶性紫杉醇转冻干粉转运实验的影响

6．4．3 实验样品处理

6．4．4 HPLC-MS／MS分析

6．4．5 数据处理

6．5 实验结果与分析

6．5．1 水溶性紫杉醇冻干粉在Caco-2模型的转运吸收

6．5．2 维拉帕米抑制剂对转运实验的影响

6．6 本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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