铅、镉诱导东北虎成纤维细胞凋亡及其机制的研究

摘要

东北虎，是世界上虎中体型最大的亚种，野生种群现主要分布于中国东北、俄罗斯远东和朝鲜北部。在我国，东北虎曾广泛分布于东北各林区，20世纪初受到人类的直接猎杀和生存环境的恶化，野生种群数量锐减，分布区逐渐缩小，现已成为世界上最为濒危的大型猫科动物之一。随着现代工农业和交通的快速发展，东北虎的生境受到严重的威胁，尤其是环境中的重金属铅、镉的污染，对东北虎的生长、发育和疾病的发生都会产生重要的影响。铅、镉可诱导各类细胞发生凋亡并对多个系统造成损伤。
　　首先围绕东北虎成纤维细胞展开生物学特性研究。细胞复苏后进行了形态学、细胞活率、细胞生长动力学、同工酶酶谱分析以及荧光蛋白基因表达等细胞质量检测与生物学特性研究。结果显示，东北虎成纤维细胞具有典型的成纤维细胞形态特征，细胞冻存前和复苏后的活率分别为96.34％±2.24％，93.72％±2.77％，差异不显著(P＞0.05)。细胞生长曲线呈“S”型曲线，同工酶酶谱表明该细胞和实验室其它物种细胞不存在交叉污染。细胞具有接受外源基因表达的能力。
　　前期保存的东北虎成纤维细胞系为高质量的、符合标准的、典型的成纤维细胞，以此作为实验材料研究铅、镉对东北虎成纤维细胞的凋亡作用及其机制。
　　通过细胞毒性分析，激光共聚焦显微镜和透射电子显微镜观察凋亡细胞显微及亚显微结构变化，彗星实验分析DNA损伤情况，流式细胞术检测细胞亚二倍体峰和凋亡率一系列实验，结果显示，32μM，64μM，125μM，250μM浓度的Pb(Ac)2和1.2μM，2.4μM，4.8μM，9.6μM浓度的CdCl2在12-48h时间内对东北虎成纤维细胞具有一定的毒性;东北虎成纤维细胞在铅、镉作用下发生特征性的凋亡形态学改变，如胞质固缩，染色质浓缩，核膜边缘化，线粒体肿胀，崩解等现象，但铅并未对细胞骨架微丝的分布、形态结构造成明显的损坏，而镉对东北虎成纤维细胞骨架微丝的分布、形态结构造成明显的损坏，微丝分布松散，顶端缩短、缺失;彗星实验表明铅、镉可使东北虎成纤维细胞DNA损伤，呈现出明显的拖尾现象;亚二倍体峰和细胞凋亡率检测结果表明，铅、镉可诱导东北虎成纤维细胞出现明显的二倍体峰，且表现出浓度依赖性，凋亡率也呈现出浓度依赖性。
　　通过细胞周期的测定，线粒体膜电位的检测，胞内钙离子稳态分析，胞内活性氧的检测，胞外钙离子流速监测，胞外钾离子流速监测，Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9酶活性的检测，RT-PCR检测等一系列实验，结果显示，铅、镉均可使细胞增殖阻滞在G0/G1期，干扰了细胞增殖活动从而诱导其凋亡;铅、镉可使东北虎成纤维细胞线粒体跨膜电位下降，结合电子显微镜观察结果可知线粒体肿胀，崩解，铅、镉破坏线粒体的功能，最终导致凋亡发生;铅、镉可打破胞内钙稳态，激活钙的凋亡信号转导作用，胞内钙离子浓度的的增加是由于内源性的钙库释放所引起的，而非吸收胞外的钙离子而升高的;铅、镉可破坏细胞氧化-抗氧化平衡，导致细胞氧化损伤;铅、镉处理东北虎成纤维细胞凋亡早期促使了钾离子外流，破坏胞质渗透压，这一研究结果为认识铅、镉诱导细胞凋亡的内在机制提供了新的证据。铅、镉诱导细胞凋亡过程中Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9酶活性呈上升的趋势，呈浓度依赖性;基因Bax与Bcl-2表达量之比值随铅、镉浓度增加而上升，Caspase-3，Caspase-8，Fas，P53表达量也随铅、镉浓度增大呈上升趋势。铅、镉通过阻滞DNA合成，破坏线粒体的功能，干扰钙稳态，氧化损伤，破坏胞质渗透压以及基因调控，介导Caspase来诱导东北虎成纤维细胞凋亡的。
　　一定浓度的铅、镉在一定的作用时间内均对东北虎成纤维细胞具有一定的细胞毒性，并可造成凋亡作用。铅、镉对东北虎成纤维细胞的凋亡作用机制也具有相似性。

目录

摘要

1 绪论

1．1 东北虎的濒危现状

1．1．1 中国野生东北虎的分布与数量

1．1．2 野生东北虎的濒危原因

1．2 重金属对森林野生动物的影响

1．3 细胞凋亡

1．3．1 细胞凋亡主要表象

1．3．2 死亡，威胁以及隐藏自我分子

1．3．3 Casepase：细胞破坏的中介

1．3．4 削弱关键的结构

1．3．5 生命维持系统的关闭

1．3．6 碎片清理：凋亡细胞处置

1．3．7 诱导细胞凋亡的因子

1．4 铅与细胞凋亡

1．4．1 铅诱导细胞凋亡

1．4．2 铅诱导细胞凋亡的机制

1．5 镉与细胞凋亡

1．5．1 镉诱导细胞凋亡

1．5．2 镉诱导细胞凋亡的机制

2 东北虎成纤维细胞生物学特性研究

2．1 前言

2．2 材料

2．2．1 细胞材料

2．2．2 主要实验仪器

2．2．3 主要实验试剂

2．2．4 主要溶液的配制

2．3 方法

2．3．1 细胞复苏

2．3．2 细胞培养

2．3．3 细胞冻存

2．3．4 细胞活率检测

2．3．5 细胞生长动力学

2．3．6 同工酶分析

2．3．7 脂质体介导荧光蛋白基因转染东北虎成纤维细胞

2．4 结果

2．4．1 细胞复苏后和冻存前的形态特征

2．4．2 细胞活率检测

2．4．3 细胞生长动力学

2．4．4 同工酶分析

2．4．5 脂质体介导荧光蛋白基因转染东北虎成纤维细胞

2．5 讨论

2．5．1 细胞活率检测

2．5．2 细胞生长动力学

2．5．3 同工酶分析

2．5．4 脂质体介导荧光蛋白基因转染东北虎成纤维细胞

2．6 小结

3 铅对东北虎成纤维细胞的凋亡作用

3．1 前言

3．2 材料

3．2．1 实验材料

3．2．2 主要实验仪器

3．2．3 主要实验试剂

3．2．4 主要实验试剂的配置

3．3 方法

3．3．1 细胞毒性分析

3．3．2 AO／EB复染观察凋亡细胞形态

3．3．3 Hoechst33258染色观察凋亡细胞核

3．3．4 透射电镜观察凋亡细胞亚显微结构

3．3．5 彗星实验

3．3．6 亚二倍体峰检测

3．3．7 细胞凋亡率的测定

3．3．8 微丝结构观察

3．3．9 统计学处理

3．4 结果

3．4．1 细胞毒性分析

3．4．2 AO／EB复染观察凋亡细胞形态

3．4．3 Hoechst33258染色观察凋亡细胞核

3．4．4 透射电镜观察凋亡细胞亚显微结构

3．4．5 彗星实验

3．4．6 亚二倍体峰检测

3．4．7 细胞凋亡率的测定

3．4．8 微丝结构观察

3．5 讨论

3．5．1 细胞毒性分析

3．5．2 AO／EB复染观察凋亡细胞形态

3．5．3 Hoechst33258染色观察凋亡细胞核

3．5．4 透射电镜观察凋亡细胞亚显微结构

3．5．5 彗星实验

3．5．6 亚二倍体峰检测

3．5．7 细胞凋亡率的测定

3．5．8 微丝结构观察

3．6 小结

4 铅对东北虎成纤维细胞凋亡作用机制的研究

4．1 前言

4．2 材料

4．2．1 试验材料

4．2．2 主要实验仪器

4．2．3 主要实验试剂

4．2．4 主要实验试剂的配制

4．3 方法

4．3．1 细胞周期检测

4．3．2 线粒体膜电位检测

4．3．3 胞内钙离子稳态分析

4．3．4 胞内活性氧检测

4．3．5 胞外钙离子流速监测

4．3．6 胞外钾离子流速监测

4．3．7 Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9酶活性检测

4．3．8 RT-PCR检测

4．3．9 统计学处理

4．4 结果

4．4．1 细胞周期检测

4．4．2 线粒体膜电位检测

4．4．3 胞内钙离子稳态分析

4．4．4 胞内活性氧的检测

4．4．5 胞外钙离子流速监测

4．4．6 胞外钾离子流速监测

4．4．7 Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9酶活性检测

4．4．8 RT-PCR检测

4．5 讨论

4．5．1 细胞周期的测定

4．5．2 线粒体膜电位的检测

4．5．3 胞内钙离子稳态分析

4．5．4 胞内活性氧的检测

4．5．5 胞外钙离子流速监测

4．5．6 胞外钾离子流速监测

4．5．7 Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9酶活性的检测

4．5．8 RT-PCR检测

4．6 小结

5 镉对东北虎成纤维细胞的凋亡作用

5．1 前言

5．2 材料

5．3 方法

5．4 结果

5．4．1 细胞毒性分析

5．4．2 AO／EB复染观察凋亡细胞形态

5．4．3 Hoechst33258染色观察凋亡细胞核

5．4．4 透射电镜观察凋亡细胞亚显微结构

5．4．5 彗星实验

5．4．6 亚二倍体峰检测

5．4．7 细胞凋亡率的测定

5．4．8 微丝结构观察

5．5 讨论

5．5．1 细胞毒性分析

5．5．2 AO／EB复染观察凋亡细胞形态

5．5．3 Hoechst33258染色观察凋亡细胞核

5．5．4 透射电镜观察凋亡细胞亚显微结构

5．5．5 彗星实验

5．5．6 亚二倍体峰检测

5．5．7 细胞凋亡率的测定

5．5．8 微丝结构观察

5．6 小结

6 镉对东北虎成纤维细胞凋亡作用机制的研究

6．1 前言

6．2 材料

6．2．1 试验材料

6．2．2 主要实验仪器

6．2．3 主要实验试剂

6．2．4 主要实验试剂的配制

6．3 方法

6．4 结果

6．4．1 细胞周期检测

6．4．2 线粒体膜电位的检测

6．4．3 胞内钙离子稳态分析

6．4．4 胞内活性氧的检测

6．4．5 胞外钙离子流速监测

6．4．6 胞外钾离子流速监测

6．4．7 Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9酶活性的检测

6．4．8 RT-PCR检测

6．5 讨论

6．5．1 细胞周期的测定

6．5．2 线粒体膜电位的检测

6．5．3 胞内钙离子稳态分析

6．5．4 胞内活性氧的检测

6．5．5 胞外钙离子流速监测

6．5．6 胞外钾离子流速监测

6．5．7 Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9酶活性的检测

6．5．8 RT-PCR检测

6．6 小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的论文

致谢

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