基于成熟合子胚外值体的水曲柳高频体胚发生研究

摘要

水曲柳(Fraxinus mandshurica)属木犀科白蜡树属，是我国东北地区重要的珍贵阔叶树种。本研究以水曲柳成熟合子胚为外植体对水曲柳体细胞胚发生体系及植株再生技术进行了系统研究，建立了高频体细胞胚发生体系。通过进行体细胞胚发生过程中的形态学观察和生物化学检测，来探讨水曲柳体胚发生中外植体细胞的死亡是否是细胞程序化死亡，为后续水曲柳体细胞胚胎发生的生化机制和分子机理研究奠定基础。具体结论如下:
　　(1)最优诱导培养基为MS1/2（MS所有成分均减半），添加5 mg·L-1NAA与2mg·L-16-BA的植物激素配比，400 mg·L-1酸水解酪蛋白(CH)，蔗糖浓度75 g·L-1，琼脂浓度6.5 g·L-1，pH为5.8。体细胞胚诱导率67.5％，主要为直接发生，发生部位大多在子叶表面和边缘;其中，约81.5％的体细胞胚在外植体褐化部位发生。
　　(2)子叶胚在添加10 mM ABA的成熟培养基上培养17 d后达到形态生理成熟，最高体细胞胚成熟率可达90.0％。最佳的次生体细胞胚诱导培养基为MS1/2，添加0.05mg·L-1NAA，400 mg·L-1酸水解酪蛋白CH，加入25 g·L-1蔗糖与6.5 g·L-1琼脂，体细胞胚增殖率93.3％。萌发培养基为1/3MS培养基，添加0.2 mg·L-16-BA、20 g·L-1蔗糖、200 mg·L-1酸水解酪蛋白CH和6.5 g·L-1琼脂。培养30 d后体细胞胚萌发率为92.0％，生根率为27.1％;生根培养基为1/3MS，添加0.01mg·L-1NAA，94.4％转化为再生植株。将体培苗转入已灭菌的，草炭土、蛭石、珍珠岩比例为5∶3∶2，用MS（无糖和激素）营养液混匀的基质中，最终移栽成活率为85％。
　　(3)形态学观察和组织学分析结果，由成熟合子胚子叶部分诱导出的体细胞胚，直接起源于表皮细胞，为单细胞起源。体细胞胚的发生过程与合子胚的发生过程类似，成熟的子叶形体胚具有明显的“Y”字形维管组织，且已经分化出子叶、胚轴、胚根;在球形胚、心形胚、鱼雷形胚及早期子叶形胚阶段，存在类似胚柄的结构，之后退化消失;已经形成的体细胞胚与周围细胞有明显界限，且很容易与周围组织分离。次生体细胞胚在原初体细胞胚的胚根端表面发生;也经历了由球形、心形、鱼雷形、子叶形几个阶段，且不同步发生，有畸形子叶胚出现。
　　(4) TUNEL细胞凋亡原位检测和DAPI细胞核染色结果显示，13 d时细胞开始相继发生PCD;17 d，19d期间，出现PCD高峰。
　　(5) H2O2含量在接种0d的时候最低;在第18 d的时候出现最大峰值，该时期处在胚性细胞向体细胞胚分化发生的阶段;超氧阴离子含量变化无明显规律。细胞总死亡量在培养的第15d，第27 d，第40d3个时期出现峰值。H2O2含量上升可诱导PCD的发生。

目录

摘要

1 绪论

1．1 植物体细胞胚发生的研究进展

1．2 植物体细胞胚发生过程中的形态学与生物化学研究

1．3 水曲柳体细胞胚发生的研究现状

1．4 本研究的目的和意义

2 水曲柳成熟合子胚的体细胞胚胎发生研究

2．1 材料与方法

2．1．1 试验材料

2．1．2 试验方法

2．2 结果与分析

2．2．1 水曲柳成熟合子胚的体细胞胚胎诱导研究

2．2．2 水曲柳成熟合子胚的体细胞胚胎成熟

2．3 讨论

2．4 本章小结

3 水曲柳体细胞胚的增殖和植株再生研究

3．1 材料与方法

3．1．1 试验材料

3．1．2 试验方法

3．2 结果与分析

3．2．1 水曲柳体细胞胚的增殖

3．2．2 水曲柳次生体细胞胚的萌发

3．2．3 体胚苗的移栽和驯化

3．3 讨论

3．4 本章小结

4 水曲柳体细胞胚发生过程中的形态学和细胞生物学观察

4．1 材料与方法

4．1．1 试验材料

4．1．2 试验方法

4．2 结果与分析

4．2．1 水曲柳体细胞胚发生的形态学观察和组织学分析

4．2．2 TUNEL细胞凋亡原位检测结果

4．2．3 DAPI染色结果分析

4．3 讨论

4．4 本章小结

5 水曲柳体细胞胚胎发生过程中的生物化学研究

5．1 材料与方法

5．1．1 试验材料

5．1．2 试验方法

5．2 结果与分析

5．2．1 活性氧代谢研究

5．2．2 超氧阴离子含量测定

5．2．3 细胞总死亡量测定

5．3 讨论

5．4 本章小结

结论

附录

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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