盐和干旱胁迫下欧李的生理响应及转录组分析

摘要

为研究欧李（Cerasus humilis）在干旱和盐胁迫下的适应机制，明确植物在逆境胁迫下生理及分了生物学响应。本研究对欧李进行盐和干旱处理，分别对抗氧化酶活性、离子含量及呼吸作用代谢物及相关酶活性方面进行测定，并通过RT-PCR对参与盐胁迫的Na+/H+逆向转运蛋白基因(NHX1)及钙依赖蛋白激酶基因(CDPK)进行定量分析，同时对干旱条件下欧李转录组测序结果做系统的分析。研究结果如下:
　　1在盐胁迫下，欧李抗氧化酶(SOD、POD、APX、GR)活性整体上增强，提高了植物对逆境的适应能力，同时细胞膜脂过氧化程度加重，过氧化产物丙二醛(MDA)含量增加，电解质渗透率加大，说明干旱胁迫对植物造成了一定的伤害。欧李根系总呼吸速率加强，交替呼吸和细胞色素呼吸两条电子传递途径也发生改变。交替呼吸随时间的延长，速率呈上升趋势，而细胞色素呼吸则呈下降趋势。
　　2盐胁迫使欧李叶片和根系K+/Na+降低，Na+含量增多，K+含量显著下降，Ca2+和Mg2+含量降低幅度较小，Cu+和Zn2+离子含量变化并不明显，各离子含量的变化表明植物在盐胁迫下一定程度上打破离子平衡，使部分离子积累，部分离子流失，造成单盐毒害和离子外流等现象，从而影响植物正常的生理代谢。
　　3 RT-PCR分析显示盐胁迫下NHX1和CDPK两基因均上调表达，这是植物对盐胁迫的一种抗性反应。
　　4在干旱条件下，可溶性糖积累，有助于植物进行渗透调节，缓解干旱给植物带来的伤害。丙酮酸含量增加，使三羧酸循环的底物充足，有利于进行呼吸作用。细胞色素C氧化酶(COX)，苹果酸脱氢酶(MDH)和柠檬酸合成酶(CS)活性均降低，其中苹果酸脱氢酶活性变化较明显，柠檬酸合成酶略降低，表明干旱使呼吸作用相关酶活性受到影响。葡糖糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PDH)和6-磷酸-葡萄糖酸脱氢酶(6-P-GDH)活性上升，可能使呼吸代谢从TCA循环更依赖于PPP途径使G-6-PDH和6-P-GDH活性增加。
　　5通过高通量测序技术（High-throughput sequencing）对欧李转录组数据进行研究，初步统计各转录本长度及序列，结果发现转录组序列在500-1000bp居多，Unigene长度所占比例略有差异。大量差异表达基因中，干旱条件下有1131个基因比对照上调表达，986个下调表达。通过Unigene功能注释分析，将Unigene进行COG、GO、KEGG分类，研究欧李的转录水平基因表达，得到相应基因的分子功能及参与的代谢途径，为以后基因水平和代谢水平的研究做铺垫。

目录

摘要

1 绪论

1．1 逆境胁迫对植物的影响

1．1．1 对抗氧化系统的影响

1．1．2 对离子含量的影响

1．1．3 对呼吸代谢的影响

1．1．4 对呼吸代谢中主要酶活性的影响

1．1．5 抗性基因在植物中的作用

1．2 二代测序技术在生物信息学中的应用

1．3 欧李的研究进展

1．3．1 欧李简介

1．3．2 欧李的研究现状

1．4 本研究的主要目的和意义

2 盐胁迫下欧李根系的生理响应

2．1 实验材料

2．2 研究方法

2．2．1 抗氧化酶活性的测定

2．2．2 丙二醛含量的测定

2．2．3 细胞膜透性的测定

2．2．4 呼吸速率的测定

2．2．5 离子含量测定

2．3 数据统计

2．4 结果与分析

2．4．1 盐胁迫下欧李根系抗氧化酶活性的变化

2．4．2 盐胁迫下欧李根系丙二醛含量和电解质渗透率的变化

2．4．3 盐胁迫下欧李根系呼吸速率的变化

2．4．4 盐胁迫下欧李组织器官中离子含量的变化

2．5 讨论

2．6 本章小结

3 与盐胁迫相关基因的表达分析

3．1 实验材料

3．2 研究方法

3．2．1 CTAB法提取总RNA

3．2．2 RNA的消化和纯化

3．2．3 RNA的反转录

3．2．4 引物的设计及合成

3．3 数据统计

3．4 结果与分析

3．5 讨论

3．6 本章小结

4 干旱胁迫下欧李幼苗叶片呼吸作用代谢物及相关酶活性的变化

4．1 实验材料

4．2 研究方法

4．2．1 可溶性糖含量测定

4．2．2 丙酮酸含量测定

4．2．3 线粒体的提取

4．2．4 呼吸相关酶活性的测定

4．3 数据统计

4．4 结果与分析

4．4．1 干旱胁迫下欧李可溶性糖含量的变化

4．4．2 干旱胁迫下欧李丙酮酸含量的变化

4．4．3 干旱胁迫下呼吸相关酶活性的变化

4．5 讨论

4．6 本章小结

5 干旱胁迫下欧李叶片转录组测序的研究

5．1 实验材料

5．2 研究方法

5．2．1 欧李总RNA的提取

5．2．2 消化纯化再检测

5．2．3 反转录及cDNA测序

5．2．4 组装

5．2．5 数据产出

5．3 数据处理和统计分析

5．3．1 原始数据产出统计

5．3．2 转录本组装

5．4 Unigene表达量分析

5．4．1 差异基因筛选及分析

5．4．2 差异基因表达模式聚类分析

5．5 Unigene功能注释

5．5．1 差异表达基因的GO分类

5．5．2 差异表达基因的COG注释

5．5．3 差异表达基因的KEGG注释

5．6 本章小结

结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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