白木香原生质体瞬时表达体系与植物MiRNA功能瞬时验证体系的建立

摘要

本研究首先利用白木香茎段及幼叶诱导白木香愈伤组织，然后分别处理了白木香愈伤与叶片，通过改变酶液浓度、组织的量、材料处理方式、酶解时间等因素探索并构建了一个有效的白木香原生质体游离体系。然后从白木香愈伤组织中提取总RNA，采用特异引物RT-PCR方法克隆倍半萜合酶ASS基因，并连接于pEZS-NL载体和pFGC5941GFP改造载体上，分别构建pFGC5941-GFP-ASS、pEZS-NL-ASS-GFP两种植物表达载体，分别利用PEG转化白木香原生质体、农杆菌侵染烟草叶片、基因枪轰击洋葱表皮细胞三种技术进行瞬时转化表达，激光共聚焦显微镜下观察表达出的绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白的表达并比较三种方法不同的表达情况。研究结果表明，将ASS导入白木香原生质体、烟草叶片表皮细胞及洋葱表皮细胞中，融合蛋白绿色荧光均能被观察到，但其在三种体系中的表达量不同，在烟草表皮细胞中的表达量最高。与此同时融合蛋白在白木香原生质体的胞质及质体定位较清晰，白木香倍半萜合酶ASS在胞质及质体定位，与其他植物中倍半萜合酶亚细胞定位的推测及研究相符。
　　研究中还选用双元表达载体pCAMBIA1200（插入烟草花叶病毒双35S启动子驱动）与pFGC5941GFP改造载体分别用于miRNA和潜在的靶基因与绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白的农杆菌瞬时表达，通过观察GFP融合蛋白的荧光，验证miRNA对潜在靶基因表达的影响。为验证这一体系的有效性，选取拟南芥已知功能的miR393及其可以抑制的靶基因AFB3，分别构建pCAMBIA1200-35 S-miR393载体和pFGC5941-GFP-AFB3载体。我们的前期研究发现瞬时转化的三种方法中，农杆菌侵染烟草叶片法的效率最高，因此利用该技术进行pCAMBIA1200-35 S-miR393、pFGC5941-GFP-AFB3两个载体共转和pFGC5941-GFP-AFB3单转的瞬时转化，激光共聚焦显微镜下观察融合蛋白的表达。只将AFB3导入烟草表皮细胞，可观察到绿色荧光;而将miR393与AFB3同时导入烟草表皮细胞后，未能观察到绿色荧光。表明miR393抑制了AFB3的表达。因此，基于农杆菌注射法的烟草（Nicotiana tabacum）瞬时表达体系能够作为植物miRNA功能的活体瞬时验证体系，为miRNA调控靶基因表达功能提供简单、快速、有效的证据，为今后研究药用植物中其它miRNA与其靶基因提供了简便可靠的体系。
　　本研究成功构建白木香叶片和愈伤原生质体游离体系，并实现了目标基因在白木香愈伤原生质体的PEG瞬时转化与表达;进而通过将该体系与农杆菌注射烟草叶片、基因枪轰击洋葱表皮细胞两种植物瞬时表达体系的比较，选用农杆菌注射烟草叶片系统和两个较小的双元表达载体构建了一个植物miRNA功能的瞬时验证体系，可用来来研究白木香乃至所有植物miRNA与靶基因的关系。

目录

摘要

1 绪论

1．1 白木香研究近况

1．1．1 沉香结香机制的研究进展

1．1．2 白木香miRNA和其他结香分子机制研究

1．1．3 原生质体及在沉香结香中的应用

1．2 MicroRNA的相关研究进展

1．2．1 MiRNA的特点

1．2．2 MiRNA的对靶位点的识别

1．2．3 MiRNA与靶基因的作用机制

1．2．4 MiRNA靶基因的鉴定方法

1．3 植物瞬时表达技术的主要方法与应用进展

1．3．1 植物瞬时表达技术的方法

1．3．2 植物瞬时表达技术的应用

1．4 药用植物与园林的关系

1．5 研究的目的意义

2 白木香原生质体瞬时表达体系的建立及与其他体系的比较

2．1 材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 质粒、菌株和试剂

2．1．3 仪器

2．2 方法

2．2．1 白木香原生质体的游离

2．2．2 构建瞬时转化载体

2．2．3 PEG介导白木香原生质体转化

2．2．4 烟草与洋葱表皮细胞的瞬时转化

2．3 结果及分析

2．3．1 白木香原生质体的游离

2．3．2 瞬时表达载体的构建

2．3．3 PEG介导ASS在白木香原生质体的瞬时表达

2．3．4 ASS在烟草叶片细胞与洋葱表皮细胞内的表达

2．4 本章小结

3 植物MiRNA瞬时表达体系的构建与验证

3．1 材料

3．1．1 植物材料

3．1．2 质粒、菌株、试剂和仪器

3．1．3 仪器

3．2 方法

3．2．1 载体构建

3．2．2 农杆菌法转化烟草叶片

3．3 结果及分析

3．3．1 pFGC5941-GFP-AFB3载体的构建

3．3．2 miR393双元表达载体的构建

3．3．3 Confocal观察miR393对AFB3-GFP融合蛋白的表达的影响

3．4 本章小结

结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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