黑斑侧褶蛙Temporin、Esculentin-1N和Esculentin-2Na抗菌肽基因的进化模式和中国种群的遗传结构研究

摘要

抗菌肽系统是两栖类最重要的先天性免疫防御系统之一。基因复制后的正选择和平衡选择作用维持了两栖类抗菌肽极高的多样性，与病原微生物进行协同进化。基因复制后，若不同分子进化方向不同，那么一定存在另外一些分子承受了很强的负选择作用，为其他分子在适应性进化过程中提供种群基本生存保障。为了验证这一假设，我们采用东洋界和古北界的广布种黑斑侧褶蛙（Pelophylax nigromaculatus）为研究对象，选择了3种具有广谱抗菌能力的抗菌肽Temporin、Esculentin-1N和Esculentin-2Na，研究其基因拷贝数、等位基因数以及变异方式。黑龙江哈尔滨(HRB)、山东东营(DY)、湖北武汉(WH)和广东茂名(GD)4个地理种群的数据显示，一个体基因组中共有7个Esculentin-1N基因单倍型、8个Temporin基因单倍型，确定两基因中至少存在4个基因座位。Temporin基因的8个单倍型全部编码同一种抗菌肽，群体分析(n=20)表明，Temporin基因成熟肽编码区无任何变异，而内含子和3'UTR区域的遗传多样性显著高于外显子2和中性核基因FIBI7内含子，排除了近期的复制事件和选择清除作用，支持强烈负选择和基因转换作用保持了Temporin基因极低的遗传多样性。Esculentin-1N基因则编码了4种不同抗菌肽，共发现4个变异位点，其中3个非同义突变。中性检验法、非保守与保守氨基酸变化比值和最大似然法均检验到正选择作用于Esculentin-1N基因，但没有达到显著性水平。支持低等程度正选择作用维持了Esculentin-1N基因较高的多样性。Esculentin-2Na为单座位基因，6个地理种群(增加黑龙江抚远-FY和河北唐山-TS)127只个体的分析发现，成熟肽编码区11个突变位点，8个为同义突变;中性检验参数显著小于0（P＜0.05）;Jukes-Cantor修正的Nei-Gojobori法计算所得dN/dS显著小于1(P=0.0176);最大似然法对每个氨基酸位点所受选择压力分析没有发现正选择位点的存在(P=1)，且92％的氨基酸位点后验平均ω＜0.2，后验概率支持均大于95％;单倍型网络呈星状分布并由短枝长相连接。支持Esculentin-2Na抗菌肽编码基因受到了强烈负选择压力的作用。上述结果表明，Tmporin和Esculentin-2Na基因受到强烈的负选择作用，在黑斑侧褶蛙抗菌肽系统中承担了基础免疫防御功能，而Esculentin-1N基因受到了低程度正选择作用，代表了抗菌肽的适应性进化。
　　为辅助对黑斑侧褶蛙抗菌肽基因进化模式的研究，我们基于线粒体控制区和中性核基因对6个地理种群黑斑侧褶蛙种群的遗传结构和遗传多样性进行了研究。结果再次验证了东北支系和大陆支系的存在，大陆支系又分支为支系A各支系B。大陆支系B仅存在TS和WH种群共享单倍型，大陆支系B共享单倍型则包括了TS、DY、WH、GD四个种群。支持支系B起源于西部高地，支系A起源于东南部沿海地区。

目录

论文说明

摘要

第一章 黑斑侧褶蛙抗菌肽基因复制后的进化模式与免疫防御策略

1 绪论

1．1 两栖类现状

1．2 两栖类免疫系统

1．3 抗菌肽概述

1．4 基因复制的普遍存在

1．5 两栖类抗菌肽多样性与基因复制

1．6 两栖类抗菌肽的基因结构

1．7 两栖类抗菌肽基因的进化模式

1．8 两栖类抗菌肽对其生存和扩散的影响

1．9 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2．1 实验用仪器设备与试剂

2．2 样本的采集与保存

2．3 基因组DNA的提取

2．4 抗菌肽基因结构的获取

2．5 对所得抗菌肽基因座位数的确定

3 结果

3．1 黑斑侧褶蛙抗菌肽的基因结构

3．2 黑斑蛙抗菌肽基因复制

3．3 两家族抗菌肽的理化性质和二级结构预测

3．4 两家族抗菌肽在不同地理区域的分布特征

4 讨论

4．1 黑斑蛙抗菌肽基因结构的比较分析

4．2 黑斑侧褶蛙抗菌肽基因复制的存在

4．3 Temporin基因成熟肽编码区的高度保守机制分析

4．4 Esculentin-1N基因复制后的低程度正选择进化模式

4．5 两家族抗菌肽的基础性免疫防御策略与适应性免疫防御策略

5 结论

参考文献

第二章 黑斑侧褶蛙抗菌肽的种内进化模式与基础免疫防御策略

1 绪论

1．1 种群水平上免疫基因的进化模式

1．2 Esculentin-2家族抗菌肽

1．3 本研究的目的和意义

2 材料和方法

2．1 实验用仪器设备、试剂与样品

2．2 Esculentin-2Na基因的获取

2．3 Esculentin-2Na基因等位基因的分离

2．4 序列分析

3 结果

3．1 单基因座位的确定

3．2 Esculentin-2Na基因编码抗菌肽的特征

3．3 Esculentin-2Na基因的进化模式

3．4 成熟肽编码区的亲缘网络关系

3．5 Esculentin-2Na家族抗菌肽的理化性质与二级结构预测

4 讨论

4．1 Esculentin-2Na抗菌肽地理分布特征与基础性免疫防御策略

4．2 Esculentin-2Na抗菌肽酸性前肽和成熟肽之间的协调进化模式

4．3 Esculentin-2Na抗菌肽基因的提高突变率及其原因

4．4 Esculentin-2Na基因的负选择进化模式与基础性免疫防御策略

5 结论

参考文献

第三章 黑板侧褶蛙中国种群的遗传多样性与遗传结构

1 绪论

1．1 黑斑侧褶蛙的分类、分布与生物学特性

1．2 黑斑侧褶蛙生存现状

1．3 黑斑侧褶蛙中国种群分子系统地理学研究概况

1．4 本研究的目的与意义

2 材料与方法

2．1 实验用仪器设备与试剂

2．2 研究对象与DNA提取

2．3 线粒体控制区DNA片段的获取与数据分析

2．4 核DNA中性基因片段的获取与数据分析

3 结果

3．1 线粒体控制区遗传变异

3．2 黑斑侧褶蛙线粒体控制区单倍型的系统发育关系

3．3 MtDNA控制区的遗传多样性与中性检验

3．4 黑斑侧褶蛙的系统地理结构

3．5 黑斑蛙种群历史动态分析

3．6 基于线粒体控制区的种群遗传分化和基因流

3．7 基于线粒体控制区的种群遗传分化与地理距离和纬度之间关系

3．8 基于核DNA的遗传变异

3．9 基于核DNA的系统进化关系

3．10 基于核DNA的遗传多样性与中性检验

3．11 基于核DNA的种群动态分析

3．12 基于核基因的种群遗传分化

3．13 基于核DNA的线性遗传分化与地理距离之间的关系

4 讨论

4．1 黑斑侧褶蛙两大支系的分化及原因

4．2 大陆支系单倍型的系统发育关系

4．3 遗传多样性的分布规律及形成原因

4．4 黑斑侧褶蛙的种群历史

4．5 黑斑侧褶蛙种群的衰退和物种保护

5 结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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