2-Cys Prx烟草遗传转化及其在盐胁迫下的光破坏防御功能初探

摘要

逆境下光合作用介导的植物细胞内会产生的氧自由基(ROS)，而ROS反过来会通过攻击光合电予传递体、光合膜和PSⅡ等，导致植物光合机构的破坏。因此，清除叶绿体内的ROS特别是叶绿体内膜的H2O2是保护逆境下植物光合机构免受伤害的前提。在逆境胁迫下，叶绿体抗坏血酸氧化酶(APX)对ROS极为敏感，ROS会使APX钝化失去活性。在APX钝化时，双半胱氨酸型硫氧还蛋白过氧化物酶(2-Cys Prx)在叶绿体中具有清除ROS的作用。2-Cys Prx是新近在酵母菌中发现的一类硫氧还蛋白过氧化物酶(Prxs)，具有清除ROS的作用，高等植物叶绿体中存在2-Cys Prx，但是，在光破坏防御中的作用机制尚不清楚。本研究通过克隆烟草叶片2-Cys Prx基因，将其转化到烟草中，利用2-Cys Prx基因过表达转基因植株，研究2-Cys Prx在叶绿体中清除H2O2的功能，探索逆境下2-Cys Prx在光破坏防御中的调控机理，为植物抗逆生理学提供理论基础和技术支撑。
　　通过反转录RT-PCR的方法从烟草品种“龙江911”叶片中克隆出2-Cys Prx基因的cDNA全长，其基因的大小为816 bp，包含了基因完整的编码序列，且与已发表的基因序列相似度99.00％以上。利用表达载体prokⅡ与2-Cys Prx基因构建了植物过表达载体，利用抑制表达载体pK7GWIWG2(Ⅱ)通过Gateway技术与2-Cys Prx基因构建了植物抑制表达载体，之后导入农杆菌LBA4404中，通过农杆菌介导法将其转入到烟草中，获得转基因植株。经基因组DNA的PCR和半定量RT-PCR的分子生物学检测后，获得过表达和抑制表达转基因植株。
　　以2-Cys Prx过表达转基因烟草为材料进行盐胁迫处理，以野生烟草为对照，测定光合暗反应活化前（调制式荧光）和暗反应活化后（连续激发式荧光）PSⅡ光化学特性，验证2-Cys Prx在光破坏防御中的作用。结果显示:盐胁迫下，野生烟草APX活性明显降低，H2O2含量升高，而2-Cys Prx过表达转基因烟草叶片中H2O2含量明显低于野生烟草，说明2-Cys Prx在APX活性降低时可清除H2O2，减轻了盐胁迫下的氧化伤害。同时发现，盐胁迫下2-Cys Prx过表达转基因烟草叶片PSⅡ原初光能转化效率（Fv/Fm）降低幅度明显低于野生烟草，而且叶绿素荧光强度比野生烟草低，K点（照光后大约300μs处的特征位点）低于野生烟草，说明通过转2-Cys Prx基因后，减轻了盐胁迫下PSⅡ供体侧的伤害程度。进一步分析发现，2-Cys Prx明显增大了叶片PSⅡ受体侧的电子受体库容量(Sm)，光合电子传递到电子传递链中超过QA-的电子受体的概率增加，减少了过多光能还原为QA，使QA的还原速率（Mo）减慢。同时发现，盐胁迫下，2-Cys Prx过表达转基因烟草叶片的非QA还原反应中心和非QB还原反应中心的比例下降程度高于野生烟草，说明2-Cys Prx在盐胁迫下提高了有活性的PSⅡ反应中心数量，将捕获的光能用于光化学反应，通过电子传递和耦联的光合磷酸化形成同化力，推动碳同化反应，减轻了盐胁迫对光合机构的伤害。
　　通过烟草2-Cys Prx基因的遗传转化研究，获得过表达和抑制表达转基因烟草，明确了2-Cys Prx作为抗氧化酶可清除ROS(H2O2)，并且在盐胁迫下APX钝化时，2-CysPrx发挥清除ROS作用，尤其是在盐胁迫下，光合机构发生光能过剩时，2-Cys Prx改变光合电子流的分配方向，减轻水裂解系统(OEC)和QA之前受体侧部分被抑制的程度，增大PSⅡ受体侧的电子受体库容量，提高了有活性的PSⅡ反应中心数量，减轻了盐胁迫的伤害。说明盐胁迫下2-Cys Prx在植物光破坏防御机制中发挥着重要的作用。

目录

摘要

1 绪论

1．1 课题背景

1．2 研究现状

1．2．1 植物中Prxs的种类和亚细胞定位

1．2．2 2-Cys Prx的催化活性

1．2．3 2-Cys Prx的结构特点

1．2．4 2-Cys Prx的生理特性

1．3 发展趋势及展望

1．4 植物表达载体

1．5 RNA干扰

1．5．1 RNAi的发现

1．5．2 RNAi的作用机制

1．5．3 RNAi的特性

1．5．4 RNAi在植物研究中的应用

1．6 Gateway技术

1．6．1 Gateway技术简介

1．6．2 Gateway技术的原理

1．6．3 Gateway技术的特点

1．6．4 Gateway技术在基因沉默中的应用

1．7 农杆菌转化法

1．8 本实验的内容及目的

1．9 实验技术路线

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 菌株与质粒

2．1．3 分子生物学试剂及生化试剂

2．1．4 主要仪器设备

2．1．5 主要培养基

2．2 2-Cys Prx基因的克隆

2．2．1 植物材料的准备

2．2．2 引物的设计与合成

2．2．3 龙江911烟草总RNA的提取

2．2．4 2-Cys Prx基因cDNA第一链的合成

2．2．5 2-Cys Prx基因cDNA全长的扩增

2．2．6 2-Cys Prx基因cDNA的纯化

2．2．7 2-Cys Prx基因全长与克隆载体pJET Vector连接

2．2．8 重组质粒(pJET-2-Cys Prx)转化大肠杆菌Trans1-T1

2．2．9 阳性克隆的筛选及鉴定

2．2．10 菌种保存与测序

2．3 植物过表达载体的构建及筛选鉴定

2．3．1 植物过表达载体prokⅡ

2．3．2 提取质粒载体prokⅡ

2．3．3 质粒载体prokⅡ和2-Cys Prx基因cDNA的双酶切反应

2．3．4 酶切产物的连接

2．3．5 转化及筛选鉴定

2．4 利用Gateway技术构建植物抑制表达载体

2．4．1 植物抑制表达载体pK7GWIWG2D(Ⅱ)

2．4．2 干扰片段的设计

2．4．3 利用attB-RNAi-S／A引物对2-Cys Prx进行PCR

2．4．4 利用attB-adapter-A／S引物进行二次PCR

2．4．5 PCR产物纯化

2．4．6 BP反应

2．4．7 LR反应

2．5 植物表达载体导入根癌农杆菌

2．5．1 制备根癌农杆菌感受态细胞

2．5．2 电击法转化LBA4404

2．5．3 农杆菌的筛选与鉴定

2．6 植物表达载体导入根癌农杆菌

2．6．1 无菌苗的获得

2．6．2 根癌农杆菌介导的烟草遗传转化

2．7 烟草转基因植株的检测

2．7．1 烟草转基因植株的分子生物学检测

2．8 烟草过表达转基因植株对盐胁迫的响应实验

2．8．1 实验处理

2．8．2 测定项目和方法

2．8．3 数据处理方法

3 结果与分析

3．1 2-Cys Prx基因cDNA全长的获得

3．1．1 总RNA的提取

3．1．2 2-Cys Prx基因cDNA全长的扩增

3．2 过表达载体prokⅡ-2-Cys Prx的构建

3．2．1 制备prokⅡ

3．2．2 质粒载体prokⅡ的酶切反应

3．2．3 用含XbaⅠ、KpnⅠ酶切位点的引物对2-Cys Prx基因PCR

3．2．4 目的基因的酶切反应

3．2．5 prokⅡ-2-Cys Prx连接产物的筛选及鉴定

3．3 植物抑制表达载体RNAi的构建

3．3．1 干扰片段的扩增

3．3．2 二次PCR

3．3．3 BP反应产物的筛选及鉴定

3．3．4 LR反应产物的筛选及鉴定

3．3．5 RNAi测序结果

3．4 植物表达载体导入根癌农杆菌

3．4．1 电击法转化根癌农杆菌LBA4404

3．4．2 过表达农杆菌阳性克隆子的筛选与鉴定

3．4．3 抑制表达农杆菌阳性克隆子的筛选与鉴定

3．5 根癌农杆菌介导的烟草遗传转化

3．5．1 烟草遗传转化体系

3．5．2 转化烟草植株

3．6 烟草转基因植株的检测

3．6．1 过表达转基因烟草中DNA的PCR检测

3．6．2 过表达转基因烟草中的半定量RT-PCR检测

3．6．3 抑制表达转基因烟草中DNA的PCR检测

3．6．4 抑制表达转基因烟草中的半定量RT-PCR检测

3．7 烟草2-Cys Prx过表达转基因植株对盐胁迫的响应实验结果

3．7．1 盐胁迫对2-Cys Prx过表达转基因烟草叶片SOD和APX活性及H2O2含量的影响

3．7．2 盐胁迫对2-Cys Prx过表达转基因烟草叶片PSⅡ电子供体侧的影响

3．7．3 盐胁迫对2-Cys Prx过表达转基因对烟草叶片PSⅡ电子受体侧的影响

3．7．4 2-Cys Prx过表达转基因对烟草叶片Fv／Fm、Fv／Fo和P／ABS的影响

3．8 小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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