羊栖菜对重金属铜的吸附及生理响应

摘要

本研究采用比较生理学与蛋白质组学、代谢组学技术相结合的研究方法，分析了低浓度(0.25、0.5 mg/L)慢性铜胁迫和高浓度(1.5、3.0 mg/L)急性铜胁迫对褐藻羊栖菜（Hizikia fusiformis）生理代谢的影响，主要结果如下:
　　1、羊栖菜吸附的重金属铜包括两部分，吸附在羊栖菜藻体表面的部分一物理吸附，以及进入羊栖菜藻体内部的部分一生物吸附。0.25 mg/L铜慢性胁迫羊栖菜7天，吸附铜的80％为生物吸附，随胁迫时间延长而显著增加。0.5 mg/L铜慢性胁迫7天，物理吸附和生物吸附量均显著增加，但生物吸附量比例下降为46％。1.5 mg/L和3.0 mg/L铜急性胁迫l天，铜吸附总量分别为0.25、0.5 mg/L铜胁迫7天的7.09、3.42倍和7.79、3.76倍，生物吸附量分别占总吸附量的31.2％和52.7％。
　　2、0.25 mg/L铜慢性胁迫下，羊栖菜生物量、相对生长速率、叶绿素荧光和叶绿素含量以及过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和丙二醛等生理指标与对照比变化不显著。0.5 mg/L铜慢性胁迫至第5天，上述指标与对照相比差异显著。1.5 mg/L和3.0 mg/L铜急性胁迫1天，羊栖菜的上述指标与对照相比变化更为明显。羊栖菜对重金属铜胁迫的生理响应与铜的生物吸附量关系更为密切。
　　3、蛋白质组学研究结果表明，0.5 mg/L铜胁迫处理7天，羊栖菜有26个蛋白质点丰度发生变化，其中6个上调，20个下调，但有4个蛋白点(spot85，369，468和1588)在数据库（NCBI和KEGG）中没有功能注释。3.0 mg/L铜胁迫处理1天，羊栖菜有30个蛋白质点丰度发生变化，22个被鉴定，其中6个上调，16个下调。经MALDL-TOF/TOF MS分析，响应慢性铜胁迫的羊栖菜蛋白主要包括参与碳水化合物代谢、能量代谢和氧化磷酸化过程中的蛋白质;响应急性铜胁迫的羊栖菜蛋白主要为参与光合作用、碳水化合物代谢、能量代谢和部分与蛋白定向相关的蛋白。
　　4、利用核磁共振(1H NMR)技术和气相色谱一质谱联用(GC-MS)技术的代谢产物研究表明，它们均属于氨基酸、糖类和三羧酸循环(TCA)中间体。核磁共振鉴定的总峰数为286个，有25个代谢产物被鉴定，其中乳酸和三甲胺上调，甘露醇、苹果酸和抗坏血酸下调，其它被发现的多元醇、有机酸和糖类均呈下调变化。气相色谱-质谱联用技术的检测结果与核磁共振结果相似，总峰数为288个，有45个代谢产物被鉴定，它们均呈下调变化，其中抗坏血酸、乳酸、苹果酸和甘露醇下调更为明显。
　　5、综合分析蛋白质组学和代谢组学研究结果，羊栖菜响应重金属铜胁迫的代谢途径包括叶绿素合成、糖酵解、三羧酸循环和抗坏血酸合成等途径。

目录

摘要

1 绪论

1．1 我国近岸海域重金属污染现状

1．2 藻类对重金属的吸附及生理响应

1．2．1 藻类对重金属的吸附

1．2．2 藻类对重金属的生理响应

1．3 羊栖菜研究现状

1．3．1 简介

1．3．2 分布、生物生态学特性

1．3．3 生理生态学

1．3．4 生物活性成分

1．3．5 重金属和砷

1．3．6 人工养殖与加工

1．4 立题依据

1．5 研究意义

1．6 技术路线

2 羊栖菜对重金属铜的吸附

2．1 材料与方法

2．1．1 羊栖菜培养和重金属铜处理

2．1．2 羊栖菜对铜的物理吸附和生物吸附测定

2．1．3 数据分析

2．2 结果与分析

2．2．1 铜慢性胁迫下羊栖菜对铜的吸附

2．2．2 高浓度铜短期胁迫下羊栖菜对铜的吸附

2．2．3 铜急性胁迫下羊栖菜对铜的吸附

2．3 讨论

2．3．1 铜慢性胁迫下羊栖菜对铜的吸附特征

2．3．2 铜急性胁迫下羊栖菜对铜的吸附特征

2．4 本章小结

3 重金属铜对羊栖菜生长的影响

3．1 材料与方法

3．1．1 羊栖菜培养和重金属铜处理

3．1．2 羊栖菜生物量测量和相对生长速率计算

3．1．3 羊栖菜叶绿素荧光观察与测量

3．1．4 羊栖菜叶绿素含量测量

3．1．5 数据分析

3．2 结果与分析

3．2．1 铜胁迫对羊栖菜生物量和相对生长速率的影响

3．2．2 铜胁迫对羊栖菜叶绿素荧光的影响

3．2．3 铜胁迫对羊栖菜叶绿素含量的影响

3．3 讨论

3．3．1 铜胁迫下羊栖菜生物量和相对生长率的变化特征

3．3．2 铜胁迫下羊栖菜叶绿素荧光的变化特征

3．3．3 铜胁迫下羊栖菜叶绿素含量的变化特征

3．4 本章小结

4 重金属铜对羊栖菜抗氧化酶的影响

4．1 材料与方法

4．1．1 羊栖菜培养和重金属铜处理

4．1．2 羊栖菜粗蛋白提取与计算

4．1．3 羊栖菜抗氧化酶活力测定

4．1．4 羊栖菜丙二醛含量测定

4．1．5 数据分析

4．2 结果与分析

4．2．1 铜慢性胁迫下羊栖菜抗氧化酶活力和丙二醛含量分析

4．2．2 铜急性胁迫下羊栖菜抗氧化酶活力和丙二醛含量分析

4．3 讨论

4．3．1 铜慢性胁迫下羊栖菜抗氧化酶活力和丙二醛含量的变化特征

4．3．2 铜急性胁迫下羊栖菜抗氧化酶活力和丙二醛含量的变化特征

4．4 本章小结

5 羊栖菜响应重金属铜的蛋白质组学分析

5．1 材料与方法

5．1．1 羊栖菜培养和重金属铜处理

5．1．2 羊栖菜粗蛋白提取

5．1．3 双向凝胶电泳

5．1．4 图像和统计分析

5．1．5 胶内消化和蛋白质识别

5．1．6 数据分析

5．2 结果与分析

5．2．1 铜慢性胁迫下羊栖菜蛋白质的表达谱

5．2．2 铜急性胁迫下羊栖菜的蛋白质表达谱

5．3 讨论

5．3．1 铜慢性胁迫下羊栖菜蛋白质的表达特征

5．3．2 铜急性胁迫下羊栖菜蛋白质的表达特征

5．4 本章小结

6 羊栖菜响应重金属铜的代谢组学分析

6．1 材料与方法

6．1．1 羊栖菜培养和重金属铜处理

6．1．2 羊栖菜代谢产物核磁共振分析方法

6．1．3 羊栖菜代谢产物气相色谱-质谱联用分析

6．1．4 数据分析

6．2 结果与分析

6．2．1 铜胁迫下羊栖菜代谢产物的核磁共振分析

6．2．2 铜胁迫下羊栖菜代谢产物的气相色谱-质谱分析

6．2．3 铜胁迫下羊栖菜氨基酸含量变化分析

6．3 讨论

6．3．1 羊栖菜甘露醇对铜胁迫的响应

6．3．2 羊栖菜氨基酸对铜胁迫的响应

6．3．3 羊栖菜谷氨酸和谷氨酰胺对铜胁迫的响应

6．3．4 羊栖菜苹果酸和天冬氨酸对铜胁迫的响应

6．3．5 羊栖菜胆碱对重金属胁迫的响应

6．3．6 羊栖菜抗坏血酸盐对铜胁迫的响应

6．4 本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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