H2S和NO促进匍枝筋骨草20E积累的转录组与蛋白质组学研究

摘要

匍枝筋骨草（Ajuga lobata）是一种富含甾酮和生物碱等多种活性物质的药用植物。目前，对筋骨草属植物中蜕皮激素类似物的应用主要集中在昆虫生长调节剂与医药保健领域的研发方面，可见来源于筋骨草属植物中的蜕皮激素类似物已倍受研究者的关注。但到目前为止，大规模工业化生产植物蜕皮激素的瓶颈问题依然存在。近年来的研究主要集中在蜕皮激素的提取与分析方法、蜕皮激素源植物的筛选及新蜕皮激素类似物的鉴定方面，而关于其基因和蛋白水平的研究却鲜有报道。本文以产β-蜕皮甾酮的愈伤组织为材料进行细胞悬浮培养，分析了H2S、NO对β-蜕皮甾酮积累的调控作用;然后以H2S、NO两种信号分子诱导的匍枝筋骨草悬浮细胞为材料，利用Illumina技术进行了转录组测序，并对H2S、NO、Control样品分别进行了数字基因表达谱分析;最后运用转录组学和蛋白质组学技术，从差异表达基因和差异蛋白层面探讨了H2S、NO诱导后匍枝筋骨草细胞的分子应答情况。主要研究结果如下:
　　1、利用细胞悬浮培养技术对H2S和NO诱导的匍枝筋骨草高产β-蜕皮甾酮细胞系进行了筛选，结果表明:1个培养周期内，根诱导的愈伤组织干重与β-蜕皮甾酮积累量显著高于叶诱导的愈伤组织;5代连续培养的悬浮细胞在第4代生长比较稳定。在细胞培养的第6d加入2mmo1/L NaHS溶液、0.5mmol/L SNP溶液处理12hr，发现H2S和NO均促进了细胞中β-蜕皮甾酮的积累，过长的处理时间、过高或过低的供体溶液浓度均对细胞中β-蜕皮甾酮的积累表现抑制作用。
　　2、利用Illumina高通量测序技术对匍枝筋骨草进行了转录组测序和de novo组装，并对得到的Unigenc进行了功能注释、分类及代谢通路分析，结果表明:得到N50值为934bp、平均长度为680bp的匍枝筋骨草Unigene共68085条，将其与NCBI的NR和Swiss-Prot数据库比对后发现，分别有46924条和28715条Unigene与其他物种的基因具有同源性。利用COG数据库可将有关的15495条匍枝筋骨草的Unigene分成25个类别，KEGG数据库分析发现共有26618个Unigene参与128种代谢通路，在甲羟戊酸途径和甾族化合物合成途径分别找到了36个和64个与植物蜕皮激素合成相关的Unigene。
　　3、利用Illumina高通量测序技术对H2S、NO诱导的匍枝筋骨草cDNA文库进行了差异基因表达谱分析，结果表明:H2S诱导下显著差异表达基因（|log2Ratio|≥2）达3012个，其中有上调表达基因1311个，下调表达基因1701个;NO诱导下差异表达基因达755个，其中有上调表达基因450个，下调表达基因305个。H2S处理后差异表达倍数在10倍(|log2Ratio|＞10)以上的差异表达基因有181个，其中上调基因140个，下调基因41个;NO处理后差异表达倍数在10倍以上的差异表达基因有9个，且均上调表达。对差异表达基因的功能注释表明，它们主要被定位于膜结构上，执行分子活性、催化活性和氧化还原酶等功能，参与了对刺激与胁迫的应答等生物学过程;此外，在植物蜕皮激素生物合成与代谢、信号转导、次生代谢产物合成等生物学过程分别注释到不同数量的差异表达基因。Pathway代谢通路分析表明，差异表达基因极显著地被注释到代谢途径与次生代谢产物生物合成2条途径中。在与植物蜕皮激素合成有关的甾族化合物和萜类化合物的生物合成途径中均显著富集到差异表达基因。
　　4、利用iTRAQ技术对H2S、NO诱导的匍枝筋骨草的差异蛋白质进行了鉴定与分析，结果表明:H2S诱导后鉴定出差异蛋白364个，其中上调蛋白质179个，下调蛋白质185个;NO诱导后鉴定出差异蛋白质141个，其中64个上调，77个下调。对差异蛋白质功能注释表明，这些蛋白主要被定位于细胞器中，执行催化与结合功能，参与了代谢过程、细胞过程、刺激响应等生物学过程。对差异蛋白质参与的pathway通路分析表明，它们被显著富集于代谢途径、次生代谢产物生物合成、苯丙烷生物合成、苯丙氨酸代谢等途径上，这些代谢途径均直接或间接地参与了匍枝筋骨草植物体中的代谢产物的合成与代谢过程。对转录组与蛋白质组关联分析表明，H2S处理/NO处理与对照的关联性较好，H2S处理与NO处理二者的关联性较差。H2S诱导后共筛选出功能已知且与转录组有关联的差异蛋白质与差异基因51个，其中关联上调8个，关联下调12个;NO诱导后共筛选出功能已知且与转录组有关联的差异蛋白质与差异基因11个，其中关联上调6个，关联下调2个，这些关联上的差异蛋白质与差异基因主要参与了生物代谢、刺激响应、胁迫应答、催化活性等生物途径。

目录

摘要

1 绪论

1．1 课题背景

1．2 植物蜕皮激素的研究概况

1．3 植物组织培养生产次生代谢产物的研究概述

1．4 H2S和NO在植物体中的研究概述

1．4．1 H2S和NO在植物体内的产生途径

1．4．2 H2S和NO在植物次生代谢合成中的作用

1．4．3 H2S的研究进展

1．4．4 NO的研究进展

1．5 诱导子调控植物次生代谢物的研究概况

1．6 “组学”技术在植物次生代谢物合成中的研究概况

1．7 本研究的目的与意义

1．8 本文研究内容

1．9 技术路线

2 H2S、NO诱导的匍枝筋骨草高产β-蜕皮甾酮细胞系筛选

2．1 材料与方法

2．1．1 试验材料

2．1．2 试验方法

2．2 结果与分析

2．2．1 高产β-蜕皮甾酮的愈伤组织筛选

2．2．2 高产β-蜕皮甾酮的悬浮培养系筛选

2．2．3 H2S、NO处理对悬浮细胞干重和β-蜕皮甾酮含量的影响

2．2．4 H2S、NO添加时期对悬浮细胞β-蜕皮甾酮含量的影响

2．3 讨论

2．4 本章小结

3 匍枝筋骨草细胞RNA-seq数据的Denovo组装与分析

3．1 材料与方法

3．1．1 供试材料

3．1．2 主要试剂及仪器设备

3．1．3 研究方法

3．2 结果与分析

3．2．1 RNA样品质量检测结果

3．2．2 转录组文库产量统计

3．2．3 de ／OrO组装结果统计

3．2．4 Unigene注释结果统计

3．2．5 基因功能注释与分类

3．2．6 预测编码蛋白框(CDS)

3．2．7 SSR分析

3．2．8 SNP分析

3．3 讨论

3．4 本章小结

4 H2S、NO诱导的匍枝筋骨草数字基因表达谱分析

4．1 材料与方法

4．1．1 供试材料

4．1．2 主要试剂及仪器设备

4．1．3 研究方法

4．2 结果与分析

4．2．1 测序数据统计与质量评估

4．2．2 测序饱和度分析与随机性评估

4．2．3 Clean tag拷贝数分布统计

4．2．4 Clean tag比对统计

4．2．5 基因表达注释

4．2．6 差异表达基因筛选

4．2．7 表达模式聚类分析

4．2．8 Go功能富集分析

4．2．9 Pathway显著性富集分析

4．3 讨论

4．4 本章小结

5 H2S、NO诱导下匍枝筋骨草蛋白质组学研究

5．1 材料与方法

5．1．1 供试材料

5．1．2 主要试剂及仪器设备

5．1．3 研究方法

5．2 结果与分析

5．2．1 蛋白质检测

5．2．2 蛋白质鉴定

5．2．3 蛋白质注释

5．2．4 差异表达蛋白分析

5．2．5 差异蛋白和差异基因的关联分析

5．3 讨论

5．4 本章小结

结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

个人简历

声明