基于白桦全基因组重亚硫酸盐测序(bisulfite-Sequencing)的甲基化图谱分析

摘要

DNA甲基化是最早发现的DNA修饰方式之一，这种修饰方式可以改变DNA构象、染色质结构和DNA稳定性，更能影响DNA和蛋白质的互作进而控制基因表达，维持基因组稳定性，控制印记基因，并且在杂种优势中有重要作用。目前，在植物领域，大多数的DNA甲基化研究主要集中在草本植物上。林木上的研究还是很少，目前只有杨树的甲基化组被研究。在本研究中，我利用重亚硫酸盐测序(bisulfite-sequencing，BS)技术结合已获得的白桦基因组，构建了单碱基分辨率的甲基化图谱，并与白桦转录组联合分析DNA甲基化对于基因表达的作用。研究中发现白桦基因组中共34，460条基因，其中31，297条基因被甲基化。白桦中14.29％的胞嘧啶被甲基化。在甲基化位点中，CHH序列占48.86％，比例远大于CG和CHG序列甲基化位点。
　　在白桦基因组不同功能元件上，都是甲基化的CG序列占主导地位，其次是CHG序列，CHH序列的甲基化水平最低。转座元件(TE)是甲基化现象最富集的区域。对Genebody、转座元件上下游甲基化水平分析，发现这种gene body两端急转回落趋，而转座元件两端缓慢回落的甲基化水平趋势。这与其他已经公布甲基化组的高等植物中甲基化趋势相同，可能是开花植物在进化上的一个共性。对白桦Introns-Exons-Introns模式水平分析发现，白桦的内含子的甲基化水平比外显子甲基化水平高，这可能是甲基化基因直接或者间接作用于调控基因转录的结果。在白桦基因组中，将甲基化的胞嘧啶mC位点的甲基化水平分成全基因组、高甲基化水平(High Methylation:ML＞=0.8)、中等甲基化水平(Intermediate Methylation:0.2＜ML＜0.8)、低甲基化水平(Low Methylation:ML＜=0.2)四组，胞嘧啶上下游的碱基出现频率相近，CG、CHG、CHH三种基元的序列均无明显偏好性。
　　为了探讨白桦基因组内基因甲基化水平与基因转录的关系，选取和白桦甲基化测序相同的植物材料，并设2个生物学重复，进行转录组测序。总计产生9544572900nt的数据，共组装出43210个Unigene，Unigene的N50达到1705nt，两个生物学重复样品的相关性达到0.976。与转录组联合分析表明，中等甲基化水平基因的表达水平高于高甲基化和低甲基化基因的表达水平。此外，GO分类表明，白桦甲基化基因高度富集于结合、催化、应激反应和细胞凋亡这些应激反应过程中。

目录

摘要

1 绪论

1．1 白桦育种简介

1．2 高通量测序简介

1．2．1 高通量测序技术

1．2．2 高通量测序主流应用

1．2．3 高通量软件介绍

1．2．4 展望

1．3 DNA甲基化简介

1．3．1 植物中的DNA甲基化

1．3．2 植物中DNA甲基化功能

1．3．3 现如今研究全基因组DNA甲基化的方法

1．3．4 植物甲基化在林木育种中的应用

2 基于白桦全基因组重亚硫酸盐测序的甲基化图谱分析

2．1 材料和方法

2．1．1 植物甲基化研究材料

2．1．2 DNA提取

2．1．3 DNA样品处理及文库构建

2．1．4 序列拼接和注释

2．1．5 全基因组DNA甲基化水平分布检测

2．2 结果与分析

2．2．1 数据统计和覆盖率分析

2．2．2 全基因组甲基化胞嘧啶C特征

2．2．3 基因组上不同功能元件上甲基化分布

2．2．4 Gene Body及上下游2K的甲基化水平分布

2．2．5 转座元件TE及上下游0．5Kb的甲基化水平分布

2．2．6 甲基化水平与基因长度的关系分析

2．2．7 甲基化水平与转座元件长度的关系

2．2．8 内含子-外显子-内含子模式(Introns-Exons-Introns)的甲基化水平分布

2．2．9 全基因组和甲基化基因的CG，CHG，CHH偏好性分析

2．3 讨论

2．3．1 BS测序技术

2．3．2 白桦全基因组DNA甲基化

2．3．3 DNA甲基化研究的发展前景

3 白桦甲基化与转录组联合分析

3．1 材料和方法

3．1．1 植物甲基化研究材料

3．1．2 RNA提取

3．1．3 RNA样品处理及文库构建

3．1．4 序列组装和注释

3．2 结果与分析

3．2．1 白桦转录组测序产量

3．2．2 白桦转录组数据组装结果分析

3．2．3 Unigene功能注释及COG分类

3．2．4 甲基化水平与转录水平关联分析

3．2．5 GO富集分析

3．3 讨论

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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