水稻(Oryza sativa L.)NADP-ME4基因表达与非生物胁迫关系研究

摘要

NADP-苹果酸酶是一类广泛存在于动物、植物以及原核和真核生物体内的氧化脱羧酶。在二价金属离子（Mg2+或Mn2+）存在下催化苹果酸氧化脱羧生成丙酮酸、CO2和NADPH从而参与植物体内不同的代谢途径。植物体中NADP-ME以同功酶的形式存在，由一个多基因家族编码，定位于细胞的质体和胞质中。
　　本研究以水稻NADP-ME4(NCBI:NM_001050754)基因为研究对象，通过Bioedit、MEGA3.1对多种植物体内NADP-ME同源性及进化关系分析结果显示NADP-ME4与胞质型AtNADP-ME1、ZmcytME的同源性较高，分别为79％、90％，且在系统进化树分布上与二者位于同一分支，而AtNADP-ME1、ZmcytME均特异性的在根中表达，同一分支的NADP-ME4也可能是胞质型非光合基因，且与根中的代谢关系较为密切。通过对NADP-ME4-GFP转基因拟南芥叶肉细胞原生质体的观察显示融合蛋白定位于细胞质中，是水稻NADP-ME基因家族胞质型成员中的一个。
　　NADP-ME4基因启动子序列中除包含基本元件TATA-box和CAAT-box外，还存在1个根特异性元件(motifⅠ，-30bp～-40bp)，一个胚乳表达相关的元件(Skn-1_ motif，-1247bp～-1253bp)及多种与环境诱导相关的元件（光、干旱、水杨酸、ABA），实验中克隆了NADP-ME4基因启动子片段连GUS报告基因，并得到转基因拟南芥，通过定量PCR检测到GUS基因在转基因拟南芥各组织器官中的表达量较低，其中在根中表达量稍高，但也仅为对照组的0.1倍。说明NADP-ME4基因启动子具有较低的活性，该基因在植物体内是低水平的组成型表达，且其表达可能受多种逆境环境因子诱导。
　　为了研究该基因与逆境环境是否存在响应关系，使用不同浓度NaCl、PEG6000、NaHCO3对水稻幼苗进行胁迫处理12h后，定量PCR检测显示水稻幼苗叶中NADP-ME4基因的表达量是降低的，而在根中该基因表达量显著增加，尤其在30mM NaHCO3处理时，根中基因表达量增加到3倍。
　　对转基因拟南芥三个株系及野生型进行不同浓度的NaCl和Mannitol胁迫处理14天后，过表达NADP-ME4基因拟南芥的三个株系在根长、鲜重、叶绿素含量生理指标上表现出比野生型较好的状态。这说明NADP-ME4基因参与植物体对盐和渗透胁迫的防御反应，提高转基因拟南芥的抗逆能力。
　　无论在基因表达水平还是转基因株系耐受性上，NADP-ME4基因均能够对多种逆境胁迫产生应答，该基因参与植物体对逆境胁迫的防御应答反应。

目录

摘要

1 绪论

1．1 引言

1．2 高等植物NADP-ME基因的研究概况

1．2．1 植物NADP-ME的分类

1．2．2 植物NADP-ME的生化特性

1．2．3 植物NADP-ME与逆境环境的应答关系

1．2．4 植物NADP-ME基因启动子的特性

1．3 本研究的目的与意义

2 水稻NADP-ME4基因的序列分析及亚细胞定位

2．1 材料与方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验方法

2．2 结果与分析

2．2．1 NADP-ME4基因的序列分析

2．2．2 转NADP-ME4-GFP基因株系Western鉴定

2．2．3 NADP-ME4在拟南芥中的亚细胞定位

2．3 本章小结

3 水稻NADP-ME4启动子克隆及表达特性分析

3．1 材料与方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验方法

3．2 结果与分析

3．2．1 NADP-ME4基因启动子的序列分析及克隆

3．2．2 启动子片段融合GUS基因的表达载体构建

3．2．3 转融合基因拟南芥的PCR鉴定

3．2．4 转基因拟南芥的GUS染色及定量PCR检测

3．2．5 水稻中NADP-ME4在逆境下的表达特性分析

3．3 本章小结

4 转NADP-ME4基因拟南芥的抗逆性分析

4．1 材料与方法

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验方法

4．2 结果与分析

4．2．1 转NADP-ME4基因株系耐盐性分析

4．2．2 转NADP-ME4基因株系耐旱性分析

4．2．3 转基因植株在逆境胁迫下的叶绿素含量变化

4．3 本章小结

5 讨论

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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