白桦BpBEE基因的功能研究

摘要

Brassinolide Enhanced Expression(BEE)基因编码植物所特有的bHLH转录因子，是调控油菜素内酯信号转导的重要元件。本实验通过构建白桦BpBEE2基因的植物过表达载体和抑制载体，进行白桦的遗传转化，对获得的转基因株系进行生长量测定和盐、旱胁迫，验证白桦BpBEE2基因所发挥的作用。主要研究结果如下:
　　1.根据白桦转录组数据，获得了3条白桦BpBEE基因，对3条白桦BpBEE基因进行生物信息学分析，结果表明，3条白桦BpBEE基因均具有典型的bHLH结构域，基因序列特性非常相似，且均有5个内含子与6个外显子。
　　2.通过实时荧光定量PCR的方法，对3条白桦BpBEE基因的表达模式进行分析，结果表明，这3条基因在叶片，雌花，雄花，茎和顶芽中均有表达，叶中BpBEE基因表达量明显高于其他部位。在生长旺盛时期，叶和顶芽中BpBEE基因均呈现上调表达，表明BpBEE基因可能参与到白桦的生长过程。BR激素处理之后，BpBEE1在早期的芽和木质部中呈显著上调;BpBEE2在早期的木质部和韧皮部显著上调外，其他处理时间也呈现不同程度的上调。表明3个白桦BpBEE基因参与BR激素应答，且BpBEE1和BpBEE2呈现早期应答响应。
　　3.应用Gateway技术构建白桦BpBEE2基因的植物过表达载体和酶切连接方法构建的白桦BpBEE2基因的植物抑制载体，采用根瘤农杆菌介导的合子胚法进行白桦的遗传转化，通过PCR鉴定转基因植株，结果表明，白桦BpBEE2基因已经成功整合到了植物基因组上，获得了1个超表达株系和5个抑制表达株系。
　　4.对获得的转基因植株进行生长量测定。结果表明:超表达株系的生长量显著高于野生型，而抑制表达株系则明显低于野生型。表明超表达BpBEE2基因能提高植株的生长量。
　　5.抗盐和抗旱的逆境胁迫分析，分别选取0.3％和0.6％ NaCl;5％和10％PEG的胁迫处理，进行鲜重和生根率统计。结果表明:转基因株系并没有显著的提高抗盐旱性。
　　6.克隆BpBEE1基因的启动子，通过原件预测，发现:该启动子含有很多与激素相关的元件;转基因拟南芥株系进行不同生长时期的组织特异性染色和激素处理后的GUS活性检测和染色，结果表明:转基因株系中GUS染色在叶脉处染色更重，MeJA处理后的GUS酶活性较未处理的明显提高，IAA和ABA处理后明显降低，与GUS染色结果相符。

目录

摘要

1 绪论

1．1 bHLH转录因子在植物生长发育过程中的研究

1．1．1 bHLH转录因子的简介

1．1．2 bHLH转录因子在植物中的的研究进展

1．2 BEE基因的研究近况

1．2．1 BEE基因的发现及命名

1．2．2 BEE基因的功能

1．3 油菜素内酯对植物生长发育过程的作用

1．4 研究的目的意义

1．5 技术路线

2 白桦BpBEE基因的获得及表达分析

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 主要试剂

2．1．3 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 白桦BpBEE基因的获得

2．2．2 白桦BpBEE基因的生物信息学分析

2．2．3 白桦BpBEE基因的表达分析

2．3 结果与分析

2．3．1 白桦BpBEE基因的生物信息学分析

2．3．2 BpBEE在白桦中的表达分析

2．4 本章小结

3 白桦BpBEE基因的启动子功能研究

3．1 实验材料

3．1．1 植物材料

3．1．2 载体和菌株

3．1．3 主要试剂

3．1．4 药品及培养基配置

3．1．5 分析工具

3．2 实验方法

3．2．1 白桦3个BpBEE基因启动子序列分析

3．2．2 pBI101-promBpBEE1启动子中间表达载体的构建

3．2．3 pBI101-BpBEE1启动子工程菌的制备

3．2．4 pBI101-promBpBEE1启动子的活性分析

3．3 结果与分析

3．3．1 BpBEE1启动子序列元件分析

3．3．2 BpBEE2启动子序列元件分析

3．3．3 BpBEE3启动子序列元件分析

3．3．4 pBI101-promBpBEE1的克隆与启动子载体构建

3．4 本章小结

4 白桦BpBEE2基因的遗传转化及分子检测

4．1 实验材料

4．1．1 植物材料

4．1．2 菌株及载体

4．1．3 酶及试剂

4．1．4 实验仪器

4．2 实验方法

4．2．1 构建BpBEE2基因的植物过表达载体和抑制表达载体

4．2．2 根瘤农杆菌介导的白桦合子胚法遗传转化

4．2．3 转BpBEE2基因植株的PCR检测

4．3 结果与讨论

4．3．1 BpBEE2基因植物过表达载体的构建

4．3．2 白桦BpBEE2植物抑制表达载体的构建

4．3．3 转BpBEE2基因植株的获得

4．4 本章小结

5 转白桦BpBEE2基因植株的生长量测定及抗逆分析

5．1 实验材料

5．1．1 植物材料

5．1．2 主要试剂

5．2 实验方法

5．2．1 培养基的配置

5．2．2 生根苗生长量测定

5．2．3 继代苗胁迫生根培养

5．2．4 统计生长量、生根率和鲜重

5．3 结果与分析

5．3．1 转基因株系生长量情况

5．3．2 转基因株系盐旱胁迫后生根情况

5．3．3 盐旱胁迫后鲜重变化情况

5．4 本章小结

结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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