84K杨独角金内酯合成和信号转导途径相关基因的克隆和功能分析

摘要

独脚金内酯(Strigolactone，SLs)是植物根系分泌物中发现的内萜类物质，属于新型植物激素，对拟南芥、水稻、豌豆、矮牵牛等多分枝突变体的研究发现独脚金内酯在植物生长发育尤其是侧枝的发生和伸长过程中起着十分重要的作用。目前对独脚金内酯合成和信号转导途径中的关键基因的研究大多集中在草本植物中，对木本植物的研究较少。本研究以84K杨为实验材料，研究了84K杨KPtrMAXs和KPtrCCDs基因在调控侧枝伸长上的功能，主要研究结果如下:
　　1.利用PCR技术，分别克隆了参与SLs合成的KPtrMAX1、KPtrCCD7、KPtrCCD8以及作用于SLs信号传导过程中的关键基因KPtrMA X2。KPtrMAX1基因CDS序列全长为1590bp，编码529个氨基酸;KPtrCCD7基因CDS序列全长为1856bp，编码619个氨基酸;KPtrCCD8基因CDS序列全长为1674bp，编码557个氨基酸。KPtrMAX2基因CDS序列全长为2106bp，编码701个氨基酸的蛋白。序列比对结果表明，KPtrMAX1、KP tr MAX2、KPtrCCD7和KPtrCCD8基因在不同物种中与MAX1、MAX2、CCD7和CCD8基因具有一定的保守性。
　　2.为验证基因的功能，分别将KP tr MAXs和KPtrCCDs构建到植物过表达载体pGWB5质粒中，采用农杆菌介导法进行拟南芥突变体的遗传转化并转入拟南芥多分枝突变体中，对转基因株系的PCR检测表明基因已经整合到拟南芥基因组中。分别对转KPtrMAXs和KPtrCCDs基因的拟南芥株系、拟南芥突变体株系及野生型拟南芥株系的表型进行观察，在已经观察了的部分性状包括叶片长度、叶柄长度、莲座叶数量、以及转KPtrMAX2基因的拟南芥株系的主花序高度和花序数量的表型统计分析表明，KPtrMAXs和KPtrCCDs能够使突变体表型部分甚至全部恢复至野生型拟南芥水平。
　　3.利用qRT-PCR技术，对KPtrMAX2基因在不同组织中的表达特性进行了分析，结果表明，KPtrMAX2在腋芽和茎中表达量最高，叶片中次之，在根中表达量最低，表明SLs由植物根部产生，向上运输至腋芽部位发挥作用。
　　4.通过农杆菌介导的方法，将KPtrMAX2基因转入84K杨中，半定量RT-PCR检测表明已获得KPtrMAX2转基因植株为进一步研究该基因的功能创制了材料。

目录

摘要

1 绪论

1．1 引言

1．1．1 植物株型形成及侧枝发育

1．1．2 植物侧枝发育与激素的关系

1．2 独脚金内酯

1．2．1 独脚金内酯的发现

1．2．2 独脚金内酯的生物合成及关键基因

1．3 独脚金内酯的生物学作用

1．3．1 独脚金内酯与侧枝发育的关系

1．3．2 独脚金内酯调控根的生长

1．3．3 独脚金内酯其他生理作用

1．4 独脚金内酯与植物激素的关系

1．4．1 独脚金内酯与生长素和细胞分裂素的关系

1．4．2 独脚金内酯与其他植物激素的关系

1．5 独脚金内酯相关基因的研究现状

1．6 本研究的目的和意义

2 KPtrMAXs和KPtrCCDs基因的克隆与序列分析

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 菌株与载体

2．1．3 药品与试剂

2．2 实验方法

2．2．1 KPtrMAXs和KPtrCCDs基因的克隆

2．2．2 KPtrMAXs和KPtrCCDs基因序列的生物信息学分析

2．3 结果与分析

2．3．1 KPtrMAXs和KPtrCCDs基因的获得

2．3．2 KPtrMAXs和KPtrCCDs基因序列结构分析

2．3．3 KPtrMAXs和KPtrCCDs基因同源性比对及系统发育树构建

2．4 本章小结

3 KPtrMAX2基因的组织特异性分析

3．1 实验材料

3．1．1 植物材料

3．1．2 药品与试剂

3．2 实验方法

3．2．1 84K杨各部分RNA的提取

3．2．2 RNA反转录成cDNA

3．2．3 调整模板

3．2．4 荧光定量PCR

3．3 结果与分析

3．4 本章小结

4 KPtrMAXs和KPtrCCDs基因的表达分析

4．1 实验材料

4．1．1 植物材料

4．1．2 菌株与载体

4．1．3 药品与试剂

4．2 实验方法

4．2．1 植物过表达载体的构建

4．3 拟南芥突变体的遗传转化

4．3．1 拟南芥的栽培

4．3．2 浸花法转化拟南芥

4．3．3 转基因植株的筛选与PCR检测

4．3．4 拟南芥突变体恢复表型的遗传功能分析

4．4 根癌农杆菌介导的84K杨的转化

4．4．1 转化方法

4．4．2 转基因84K杨植株的分子检测

4．5 结果与分析

4．5．1 35S：KPtrMAXs和35S：KPtrCCDs的构建

4．5．2 35S：KPtrMAXs和35S：KPtrCCDs转拟南芥突变体分子检测

4．5．3 农杆菌介导的84K杨遗传转化

4．6 本章小结

结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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