棘孢木霉Hsp24基因转化山新杨培育抗病转基因株系

摘要

杨树具有无性繁殖容易、生长速度快和生长周期短的特性，是重要的纤维用材，在全世界被广泛种植。然而许多生物及非生物因子对杨树的生长造成了严重的影响，减少了木材产量。而木霉作为优良的生防真菌，具有大量的防卫响应及抗病基因，如热激蛋白基因，其在木霉的生物防治机制中起到了十分重要的作用。
　　本实验以棘孢木霉ACCC30536转录组测序数据为基础，克隆到了热激蛋白基因Hsp24的DNA序列，由于此基因无内含子，cDNA与DNA序列一致，GenBank接受号为KP337939，全长为657bp，编码218个氨基酸。生物信息学分析表明，热激蛋白Hsp24的分子量为24.3kDa，等电点是5.50，属于Hsp20家族。通过实时荧光定量方法，研究了棘孢木霉ACCC30536热激蛋白基因Hsp24在10种条件下的表达特性，结果显示，在碱、盐、干旱、高温和杨树叶枯病及烂皮病发酵液胁迫下，热激蛋白基因的表达量均上调，尤其在高温和杨树烂皮病胁迫下上调最高，分别为51.6和31.1倍。
　　为了构建具备良好抗病性的山新杨转化子，通过农杆菌介导的方法将Hsp24基因整合到山新杨基因组上，并成功得到重组株系Pdpap-Hsp24s。RT-qPCR检测发现对照山新杨Pdpap-Con中无Hsp24基因表达，而山新杨转化子Pdpap-Hsp24s中Hsp24基因大量表达，证实Hsp24已经在转化子中成功的转录。转基因杨树病程相关蛋白基因PR表达检测发现转化子pROK2-Hsp24s中的大部分PR基因上调表达，尤其是转化子Pdpap-Hsp24-3中的PR-8被上调了215.93倍。
　　在杨树烂皮病的胁迫下，杨树抗病信号传递相关基因的RT-qPCR发现Pdpap-Hsp24-3中的NPR1基因被上调了4.76倍，Pdpap-Hsp24-1中的JAR1和MYC2分别被上调了2.35和4.08倍。进而，NBT及EtBr叶片染色发现转化子Pdpap-Hsp24s与对照Pdpap-Con相比叶片的颜色更浅，表明转化子Pdpap-Hsp24s具有更强的抗杨树烂皮病的能力。POD及SOD酶活性检测发现Pdpap-Hsp24s与Pdpap-Con相比，POD及SOD酶活性更高，最高时分别达到37.7U和51.17U;用叶枯病侵染叶片后，发现Pdpap-Hsp24s和Pdpap-Con的叶片发病率分别为53％和81％，表明山新杨转化子Pdpap-Hsp24s具有更强的抗杨树叶枯病的能力。
　　综上所述，棘孢木霉ACCC30536热激蛋白Hsp24基因在山新杨中的表达提高了转化子Pdpap-Hsp24s的抗病能力。本研究使人们更加深刻的了解了真菌热激蛋白能够在木本植物中成功表达，同时也提供了一种提高山新杨抗真菌病原菌能力的有效方法。

目录

摘要

1 绪论

1．1 课题背景及意义

1．2 国内外文献综述及研究进展

1．2．1 植物转基因概述

1．2．2 生防木霉与病原菌互作

1．2．3 热激蛋白的功能

1．3 研究不足及待深入研究的问题

1．4 课题来源及研究内容

1．4．1 课题来源

1．4．2 研究内容

2 棘孢木霉热激蛋白基因Hsp24的克隆及分析

2．1 实验材料

2．1．1 质粒及菌株

2．1．2 培养基及缓冲液

2．1．3 药品

2．1．4 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 棘孢木霉基因组DNA的提取

2．2．2 棘孢木霉Hsp24基因的克隆

2．2．3 Hsp24启动子区序列克隆

2．2．4 Hsp24基因及蛋白的生物信息学特征

2．3 实验结果

2．3．1 棘孢木霉基因组DNA的提取

2．3．2 棘孢木霉Hsp24基因的克隆

2．3．3 棘孢木霉Hsp24基因启动子区克隆及分析

2．3．4 棘孢木霉Hsp24基因的序列分析

2．3．5 热激蛋白Hsp24的生物信息特征分析

2．4 热激蛋白基因的克隆及生物信息分析的讨论

2．4．1 棘孢木霉Hsp24基因的克隆

2．4．2 热激蛋白及其基因的生物信息分析

2．5 本章小结

3 棘孢木霉热激蛋白基因Hsp24的差异表达

3．1 实验材料

3．1．1 菌株

3．1．2 培养基

3．1．3 药品及工具酶

3．1．4 实验器材

3．2 实验方法

3．2．1 棘孢木霉Hsp24基因的表达差异

3．2．2 荧光定量PCR实验

3．3 实验结果

3．3．1 Hsp24基因在MM培养基中的表达

3．3．2 生物因素胁迫下Hsp24基因的表达

3．3．3 非生物压力胁迫下Hsp24基因的表达

3．4 棘孢木霉Hsp24基因表达情况的讨论

3．4．1 生物因素对Hsp24基因表达的影响

3．4．2 非生物因素对Hsp24基因表达的影响

3．5 本章小结

4 山新杨转化子Pdpap-Hsp24s的获得

4．1 实验材料

4．1．1 植物材料、菌株和质粒

4．1．2 培养基

4．1．3 药品和酶制剂

4．1．4 实验仪器

4．2 实验方法

4．2．1 重组载体pROK2-Hsp24的构建

4．2．2 重组根癌农杆菌EHA105-Hsp24的构建

4．2．3 山新杨转化子Pdpap-Hsp24的获得

4．3 实验结果

4．3．1 重组载体pROK2-Hsp24的构建

4．3．2 山新杨转化子Pdpap-Hsp24的扩繁与检测

4．4 植物表达载体构建及杨树转基因的讨论

4．5 本章小结

5 山新杨转化子Pdpap-Hsp24s的抗病性检测

5．1 实验材料

5．1．1 植物材料及病原真菌菌株

5．1．2 培养基

5．1．3 药品和酶制剂

5．1．4 实验仪器

5．2 试验方法

5．2．1 四个转化子株系中病程相关蛋白的表达分析

5．2．2 杨树烂皮病胁迫下杨树转化子防卫信号途径相关基因的分析

5．2．3 杨树烂皮病胁迫下山新杨转化子细胞膜透性及活性氧含量测定

5．2．4 叶枯病菌胁迫下杨树转化子Pdpap-Hsp24抗氧化能力分析

5．2．5 山新杨转化子Pdpap-Hsp24的抗叶枯病能力检测

5．3 实验结果

5．3．1 山新杨转化子中病程相关蛋白基因PR的表达检测

5．3．2 杨树烂皮病的胁迫下杨树转化子防卫信号途径相关基因的表达

5．3．3 杨树烂皮病的胁迫下杨树转化子的细胞膜透性及活性氧含量

5．3．4 杨树叶枯病的胁迫下杨树转化子的抗氧化能力分析

5．3．5 转化子Pdpap-Hsp24的抗杨树叶枯病能力检测

5．4 山新杨转化子Pdpap-Hsp24抗病能力讨论

5．4．1 转化子Pdpap-Hsp24病程相关基因的表达

5．4．2 转化子Pdpap-Hsp24抗杨树烂皮病的能力

5．4．3 转化子Pdpap-Hsp24抗杨树叶枯病的能力

5．5 本章小结

结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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