野菊(Chrysanthemum indicum)ChiMYB基因克隆及其功能的初步研究

摘要

草本植物野菊的药物应用价值已具有几百年的历史记载，含消炎、抗氧化及免疫调节等成分。野菊花黄色，抗逆性强，易于繁殖，在园林中具有较高的应用价值。基因工程研究对改良观赏植物野菊的观赏及品质性状，培育优良的野菊新品种具有十分重要的意义。MYB转录因子对植物的生物进程起重要的调控作用，本研究欲探究野菊MYB转录因子在其生长发育进程中的作用，通过转基因方法使ChiMYB在烟草中过量表达，来研究ChiMYB基因的调控潜能。本研究以野菊(Chrysanthemum indicum)为实验材料，利用本实验室前期已获得的特异性引物克隆野菊MYB基因，并对其进行生物信息学分析；构建过表达植物载体，转化烟草；测定转ChiMYB基因烟草的表型和光合特性，初步探究了ChiMYB基因能够抑制光合通路上光合酶及光合色素基因表达，使相关酶及色素合成受阻，导致净光合速率下降，即ChiMYB基因具有转录抑制因子的功能。以期更好的发挥野菊的多途径利用价值及改善野菊品质，同时也为野菊分子育种奠定基础。研究结果如下：
　　1.以野菊实生苗叶片总RNA为模板，通过RT-PCR方法扩增得到一个MYB类转录因子基因，将其命名为ChiMYB，利用生物信息学方法对ChiMYB基因编码的氨基酸序列进行分析，结果表明：MYB基因全长为1194bp，ORF为948bp，编码315个氨基酸；该基因所编码氨基酸序列属于SANT超家族，含SANT结构域，行使DNA结合结构域的功能，且分析结果显示ChiMYB基因可能具有转录抑制因子的功能；系统进化树分析显示，野菊的ChiMYB与菊花和神农香菊的MYB同源性较高，次之是与菊科菜蓟的同源域蛋白同源性较高。
　　2.在已获得野菊ChiMYB基因全长的基础上，构建克隆载体；利用双元表达载体pBI-121上的XbaI和SpeI两个酶切位点，双酶切构建pBI121-MYB植物表达载体；利用电转化法成功将pBI121-MYB重组质粒和pBI121空载体质粒导入农杆菌EHA105中；农杆菌介导法将ChiMYB基因和pBI121转入烟草植株体内，通过抗性筛选和抗性植株DNA的PCR检测，证明已成功过获得多个转ChiMYB基因和转pBI121空载体的阳性株系，共选出3个转ChiMYB基因株系和1个转pBI121株系。
　　3.对转ChiMYB基因烟草与对照WT、EV进行外观及光合特性测定，初步探究ChiMYB基因功能。研究结果发现，转ChiMYB基因烟草与对照WT、EV相比，在表型及光合特性上有一系列变化：转ChiMYB基因烟草三个株系L1、L2、L3与WT、EV比较，叶片黄化，且叶面积显著下降，茎发生了横向弯曲，且萌蘖出侧芽；转基因烟草三个株系L1、L2、L3较WT、EV的最大净光合速率、气孔导度、蒸腾速率及表观量子效率显著下降；绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素含量下降显著，其平均值分别仅为WT和 EV的53.8%、46.5%、52.1%、49.1%和47.6%、46.1%、47.2%、48.5%，叶绿素a/b差异不显著；叶绿素荧光参数中只有非光化学猝灭系数显著下降，其平均值较WT和EV分别降低了23.8%和23.3%，光化学猝灭系数下降但差异不显著，初始荧光、最大荧光、PSII最大光化学效率，PSII实际光化学效率与WT和EV没有显著差异。

目录

1绪论

1.1野菊的研究进展

1.1.1野菊的化学成分研究进展

1.1.2野菊的应用价值研究进展

1.2植物MYB转录因子的研究进展

1.2.1 MYB转录因子的结构

1.2.2 MYB转录因子的进化

1.2.3 MYB基因的组织特异性表达

1.2.4 MYB基因的功能

1.3研究的目的与意义

2野菊(Chrysanthemum indicum)MYB 基因克隆及生物信息学分析

2.1实验材料与方法

2.1.1实验材料

2.1.2实验方法

2.2结果与分析

2.2.1 MYB全长序列克隆

2.2.2 ChiMYB基因全长序列的生物信息学分析

2.3本章小结

3 ChiMYB基因植物表达载体的构建及转化烟草

3.1实验材料与方法

3.1.1实验材料

3.1.2实验方法

3.2结果与分析

3.2.1植物表达载体的构建

3.2.2转ChiMYB基因烟草的获得

3.3本章小结

4转ChiMYB基因对烟草表型及光合作用的影响

4.1材料与方法

4.1.1实验材料

4.1.2实验处理

4.1.3实验方法

4.2数据处理

4.3结果与分析

4.3.1转基因植株的形态分析

4.3.2转ChiMYB 基因对烟草光合特性的影响

4.3.3转ChiMYB基因对烟草叶片叶绿素荧光参数的影响

4.3.4转ChiMYB基因对烟草叶片叶绿素含量的影响

4.4本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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