白桦miR156及其靶基因BpSPL9的功能研究

摘要

SPL是植物特异性的转录因子家族，通过调节各种生理生化过程在植物生长和发育中起到重要作用。本实验通过构建白桦BpSPL9基因的植物抑制表达载体和miR156的过表达载体，进行白桦的遗传转化，对获得的转基因株系进行表型观测，并验证白桦miR156和BpSPL9基因的功能及调控关系。主要研究包括:
　　1.应用Gateway的方法构建白桦BpSPL9的植物抑制表达载体，采用根瘤农杆菌介导的合子胚法进行白桦的遗传转化，通过PCR和定量PCR的方法检测转基因植株，结果表明，白桦BpSPL9基因已经成功整合到了植物的基因组上。通过对BpSPL9抑制表达转基因白桦株系进行表型观测，发现转基因株系苗高比对照植株的苗高低30.34％，地径低6.24％，单株叶片数量少于26.03％，第七八片叶叶面积分别低于42.87％和50.91％，叶片长宽比低于27.21％和27.99％，叶间距主要分布在8-14mm之间，而非转基因对照植株的节间距分布在10-14mm之间。对转基因植株进行激素含量测定，结果表明:GA3、IAA及6-BA含量较非转基因植株含量降低。
　　2.应用Gateway技术构建白桦miR156的植物过表达载体，采用根瘤农杆菌介导的合子胚法进行白桦的遗传转化，通过PCR和定量PCR的方法鉴定转基因植株，结果表明，白桦miR156已经成功整合到了植物的基因组上。并且转基因植株的miR156表达量高于非转基因对照植株。通过对转miR156白桦株系进行表型观察，发现其苗高比对照植株的苗高39.88％，地径高18.41％，单株叶片数量多于46.74％，第七、八片叶叶面积分别低于58.92％和75.60％，叶片长宽比高于4.47％和4.53％，叶间距主要位于6-8mm，而对照植株的节间距主要位于10-14mm，节间距比对照植株短。对转基因植株进行激素含量测定，结果表明:GA3、IAA、BR及6-BA含量较非转基因植株含量增加，叶绿素含量及花青素含量也都有明显增加。白桦12条SPL基因家族中7条有microRNA156识别位点，通过对miR156过表达转基因株系的定量分析，选取表达量较高的2个号的cDNA为模板，对7条SPL基因进行定量分析，定量PCR结果表明:BpSPL5、BpSPL8、BpSPL9、BpSP11、BpSPL12基因表达量有所下降，表明这5条基因受miR156的调控，miR156和BpSPL9基因呈现负调控的关系。

目录

摘要

1 绪论

1．1．2 SPL基因的功能

1．2 植物microRNA的功能及对靶位点的调控

1．2．1 植物microRNA的生物学功能

1．3 研究的目的意义

1．4 实验技术路线

2 白桦BpSPL9抑制表达载体的构建及遗传转化

2．1．1 植物材料

2．1．2 菌株及载体

2．1．3 酶及试剂

2．2 实验方法

2．2．1 BpSPL9抑制表达载体的构建

2．2．2 根瘤农杆菌介导的白桦的遗传转化

2．2．3 转基因植株的分子检测

2．3 结果与分析

2．3．1 BpSPL9抑制表达载体的构建

2．3．2 转基因植株的获得

2．3．3 转BpSPL9抑制表达植株的分子检测

2．4 本章小结

3 转BpSPL9抑制表达转基因白桦的表型观察及激素测定

3．1 实验材料

3．1．1 植物材料

3．1．2 仪器设备

3．1．3 试剂

3．2．1 BpSPL9抑制表达转基因株系的苗高、地径观测

3．2．2 BpSPL9抑制表达转基因株系的叶片数、节间距观测

3．2．3 BpSPL9抑制表达转基因株系的叶面积、叶片长宽比观测

3．2．4 BpSPL9抑制表达转基因株系的的激素测定

3．3 结果与分析

3．3．1 转BpSPL9抑制表达白桦的表型观

3．4 本章小结

4 白桦miR156植物过表达载体的构建及遗传转化

4．1．1 植物材料

4．1．2 菌株及载体

4．1．3 酶及试剂

4．2 实验材料

4．2．1 miR156植物超表达载体的构建

4．2．2 转基因植株的获得

4．2．3 转miR156的定量PCR分析

4．3 结果与分析

4．3．1 miR156过表达载体的构建

4．3．2 转基因植株的获得

4．3．3 miR156超表达植株的分子检测

4．4 本章小结

5 转miR156过表达转基因白桦的表型观察、相关激素的测定及调控SPLs基因的表达分析

5．1．1 植物材料

5．1．2 仪器设备

5．1．3 主要试剂

5．2 实验方法

5．2．5 miR156转基因株系的叶绿素和花青素的测定

5．2．6 白桦miR156调控SPLs基因的表达分析

5．3 结果与分析

5．3．1 miR156转基因株系的表型鉴定

5．3．2 miR156转基因株系的GA3、IAA、6-BA、BR激素的测定

5．3．3 miR156转基因株系的叶绿素和花青素测定

5．3．4 白桦miR156过表达调控SPLs基因的定量分析

5．4 本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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