肝硬化大鼠膈肌细胞骨架蛋白表达与收缩特性的关系

摘要

目的：研究肝硬化对大鼠膈肌的损伤作用及机制；探讨肝硬化晚期低氧血症的发生机制。
　　方法：成年雄性Sprague-Dawley大鼠30只，随机分成2组，对照组（Control,CON.n=10）腹部皮下注射等量的生理盐水，给予正常饲料和自来水；肝硬化组（Liver cirrhosis, LC. n=20）。采用 CCl4复合因素建立肝硬化大鼠模型（肝硬化组第一天腹部皮下注射0.5ml/100gCCl4原溶液，以后每隔3天注射40％CCl4油溶液0.3ml/100g，单纯玉米面（前2周为20%猪油混入）混入0.5%胆固醇，30%酒精为其唯一饮料，共8周复制肝硬化模型)，共成模15只（经肝脏组织切片病理证实）。第9周进行实验。以20%氨基甲酸乙酯（5ml·㎏-1,ip）麻醉后行气管插管，记录呼吸功能参数：呼吸频率（RF）、潮气量（VT）、肺通气量（PV）、最大肺通气量（MVV）；动脉血气分析：检测二氧化碳分压（PaCO2）、氧分压（PaO2）、氧饱和度(SaO2)及 pH值；应用体外灌流大鼠膈肌条的方法，采用Medlab-U/4c生物信号采集处理系统记录并测量其单收缩张力（Pt）、最大强直张力（Po）、峰值收缩时间(CT)、半舒张时间(1/2RT)、张力最大上升速率(+dT/dtmax）、张力最大下降速率(-dT/dtmax)、张力-频率曲线(Force-frequency curve)及疲劳指数(FI)的变化，同时测定膈肌组织超氧化物歧化酶（SOD)和琥珀酸脱氢酶(SDH)的活性及丙二醛(MDA)和髓过氧化物酶(MPO)的含量；应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测膈肌组织中肌浆网钙泵（SERCA）及骨架蛋白titin，nebulin的基因表达的变化；并用光镜和电镜观察膈肌组织的形态和超微结构的变化。
　　结果：1.大鼠体重和膈肌/体重比：LC组明显低于 CON组（p﹤0.01）；2.大鼠呼吸功能的变化：LC组呼吸频率、潮气量、肺通气量、最大肺通气量均明显低于CON组（p﹤0.01）；3.大鼠动脉血气分析：LC组pH值虽有降低及二氧化碳分压有所升高，但与CON组相比无显著差异（p﹥0.05），但氧分压、氧饱和度均明显低于 CON组（p﹤0.01）；4.大鼠膈肌的各项力学指标：单收缩张力、最大强直张力、张力最大上升速率、张力最大下降速率与疲劳指数，LC组明显低于CON组（p<0.01），单收缩的峰值收缩时间和半舒张时间， LC组与CON组相比明显延长（p﹤0.01）；5.张力-频率曲线变化：给予10、20、40、60、100 Hz频率的方波电压刺激膈肌条，LC组张力明显低于CON组（p﹤0.01）；6.大鼠膈肌组织的SOD、SDH的活性LC组均明显低于CON组（p<0.01），MDA、MPO的含量LC组均明显高于CON组（p﹤0.01）；7.RT-PCR检测titin、nebulin、SERCA mRNA含量，LC组比CON明显降低（p﹤0.01）；8.光镜下膈肌组织的形态变化及透射电子显微镜显示膈肌超微结构的改变：光镜下，LC组大鼠膈肌肌纤维紊乱、萎缩甚至断裂；电镜下大鼠膈肌肌丝紊乱、断裂，Z线不清或消失；线粒体数量减少，水肿扩张，嵴模糊断裂，大量线粒体空泡化或囊泡化，有髓板样物形成；肌浆网明显扩张。
　　结论：肝硬化导致膈肌收缩和舒张功能下降，以致大鼠出现呼吸困难，晚期发生低氧血症，其机理与肝硬化导致膈肌抗氧化酶活性降低，自由基生成增多，脂质过氧化增加，线粒体损伤和功能障碍及其酶活性降低，炎症反应增强，超微结构受到破坏，titin，nebu-lin，SERCAmRNA表达减少有关。

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前言

材 料 与 方 法

1. 药品与试剂

2. 特种气体

3. 主要仪器与设备

4.动物模型建立与分组

5.呼吸功能测定

6.动脉血气分析

7. 膈肌标本制备

8.离体膈肌张力测定

9.生化指标检测

10.光学显微镜观察

11.电子显微镜观察

12.RT-PCR检测膈肌骨架蛋白titin、nebulinmRNA及肌浆网SERCAmRNA表达

13.统计学处理

结果

1．各组大鼠一般情况

2.呼吸功能的测定

3.动脉血气分析

4.膈肌的收缩特性

5.膈肌收缩的张力-频率关系

6.膈肌耐力的变化

7.膈肌组织生化指标测定

8.光镜下大鼠膈肌形态学观察

9.电子显微镜下膈肌超微结构的变化

10.膈肌骨架蛋白titin、nebulin和肌浆网SERCA mRNA的表达

讨论

1．肝硬化对大鼠离体膈肌收缩舒张功能的影响

2．肝硬化致膈肌自由基损伤的作用

3．肝硬化致膈肌线粒体损伤的作用

4．肝硬化对膈肌骨架蛋白titin、nebulin和肌浆网钙泵SERCA的影响

结论

参考文献

致谢

附录A中英文词汇及缩写对照表

附录B个人简历：

附录C 综述: 肝肺综合征发病机制的研究进展