拟果蝇细胞系建立及6种果蝇PVR基因的分子系统学研究

摘要

拟果蝇细胞系的建立：以拟果蝇早期胚胎为材料，采用常规方法获取发育4-6h的果蝇胚胎细胞，用改良的M3(BF)培养液体外培养，经50d左右的原代培养，当小细胞长满培养皿后进行传代培养，以后平均每隔10d传代一次。在细胞系传至10代左右时按照细胞系建立标准检测细胞系的一系列生物学特性。结果显示：24h后细胞贴壁，开始分化，先后依次观察到肌肉细胞，神经细胞，脂肪细胞，鳞状上皮细胞，血囊细胞的分化。2个月后所有这些分化的细胞都逐渐消失，只剩下生长较为一致的圆形小细胞。当圆形小细胞长满培养皿时进行传代。经液氮冻存的细胞复苏后活性达90％以上。细胞维持体外生长将近2年，传至60代，是一株成功的拟果蝇细胞系，命名为LJY-SIM。
　　 6种果蝇PVR基因的分子系统学研究：通过PCR扩增和克隆测序的方法，获得了黑腹果蝇种亚组内的6个种的PVR基因的序列。以细针果蝇(Drosophila eugracils)为外群，运用邻接法，最大似然法和贝叶斯法三种方法构建了melanogaster种亚组的系统进化树，对其系统发育关系进行了分析，并利用bootstrap对分析结果进行了置信度检验。分子进化分析表明：这个基因的编码区段高度保守，明显表现出受到纯化选择的痕迹，其超高的Ks/Ka比值及GCIII含量都充分显示如此。而这个基因的内含子区存在明显的插入和缺失，包含有丰富的进化信息。基因树表明：D.melanogaster最先分化出来，然后是D.simulans和D.mauritiana，接着是，它们聚为单独的一个亚支系，D.erecta，D.teissieri和D.yakuba聚为第二个亚支系，其中D.erecta先分化出来。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一部分 文献综述

1 动物细胞培养技术的应用现状及发展前景

1.1 动物细胞培养技术的应用现状

1.2 动物细胞培养技术的发展前景展望

2 分子系统学研究进展

2.1 分子系统学的定义及发展简史

2.2 分子系统学的研究方法及应用情况

2.3 分子系统学研究中存在的主要问题

第二部分 拟果蝇细胞系的建立

1 前言

2 材料和方法

2.1 实验材料

2.2 试剂及其配制

2.3 建系过程

3 结果

3.1 原代培养结果的观察

3.2 传代培养

3.3 细胞系中细胞的形态学特征

3.4 细胞冻存

3.5 核型观察

4 讨论

4.1 细胞成系标准

4.2 建系中需注意的事项

4.3 细胞对培养条件的适应性及要求

4.4 目的细胞的来源和性质

4.5 胚胎发育时间

第三部分 黑腹果蝇种亚组PVR基因的分子系统学研究

1 前言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 试剂和仪器

2.3 实验方法

3 数据处理

3.1 序列编辑及排序

3.2 数据分析

3.3 系统进化分析

4 结果与分析

4.1 PVR的测序结果

4.2 系统进化分析

4.3 检验

5 讨论

5.1 PVR基因的分子进化分析

5.2 Melanogaster种亚组的系统进化

5.3 对所用构树软件的分析

参考文献

致 谢