脑缺氧缺血后神经细胞死亡及新生细胞形成的研究

摘要

新生儿缺氧缺血(hypoxia ischemia，HI)性脑损伤是严重威胁新生儿健康、导致新生儿死亡和儿童神经系统伤残的主要原因。对于HI，大脑表现为神经损伤与神经保护并存状态。HI后，大量神经细胞死亡，其机制尚未完全清楚，近来研究发现，凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor，AIF)触发的半胱天冬酶(caspase)非依赖凋亡途径以及过量NO所致的亚硝酰基化作用在细胞损伤中发挥重要作用，本研究采用免疫组化、免疫荧光、Western蛋白印迹、酶活性检测等生物学技术探讨AIF以及硝基酪氨酸在未成熟脑缺氧缺血诱导的神经细胞死亡中的作用，进一步明确了神经细胞死亡的发生机制。 在大脑的多种适应性反应中，神经干细胞增生且分化产生新的神经细胞将对脑组织损伤后的修复起到重要作用，但在脑发育的不同阶段神经细胞的增生与分化及在HI后的改变尚未见详细报道。 本研究通过注射新生细胞标记物Brdu(5-bromo-2-deoxyuridine，5-溴脱氧尿嘧啶核苷)，并采用免疫组化、免疫荧光以及立体测量系统和激光共聚焦成像技术阐述了新生小鼠脑组织发育过程中细胞增生与分化的规律以及HI后的变化，并比较了新生儿期与青少年期不同年龄脑海马区细胞增生与分化的异同，为新生儿缺氧缺血性脑损伤的临床干细胞治疗提供了理论依据。 对象：缺氧缺血组Wistar 7日龄新生大鼠147只，随机分为HI后0min、30min、1h、3h、8h、14h、24h、72h(每时间点n=12)，BAF干预组42只，2-亚氨基生物素干预组9只；正常对照组Wistar大鼠60只，随机分为出生后第0d、3d、7d、8d、10d、14d、21d、42d、成年(7d组n=12，余每时间点n=6)。 C57/BL6 9日龄新生雄性小鼠45只，随机分为三组，其中缺氧缺血组各10只，正常对照组各5只；21日龄雄性小鼠15只，其中缺氧缺血组10只，正常对照组5只。方法：1缺氧缺血脑损伤模型制作：1.5％-3.5％安氟醚吸入麻醉，结扎左侧颈总动脉，术后1h给予动物吸入湿化氮氧混合气，其浓度和吸入时间在7d大鼠、9d小鼠、21d小鼠不同，分别为7.7％，55min；10％，35min；10％，30min。2给药方法及药物剂量：BAF于HI后2h、12h脑室注射，每次剂量5μl；HI后即刻腹腔注射2-亚氨基生物素，剂量：20mg/kg(10μl/g)；Brdu于不同组间HI后1d、1w、2w开始腹腔注射，每次剂量50mg/kg，每天一次，连续七天。3免疫组化染色：检测AIF，MAP-2，细胞色素C，硝基酪氨酸，活性caspase-3，发夹寡核苷酸探针(HPP)原位杂交，Brdu。4免疫荧光染色：检测AIF-HPP-Hoechst33342，AIF-TUNEL-Hoechst 33342，AIF-细胞色素C-Hoechst 33342，AIF-COX，AIF-MAP-2，硝基酪氨酸-AIF-Hoechst 33342，HPP-硝基酪氨酸-Hoechst 33342，caspase-3-硝基酪氨酸-Hoechst 33342，Brud-NeuN，Brdu-APC，Brdu-Ibal，Brdu-S100β。5 Western蛋白印迹：检测细胞色素C、细胞色素氧化酶Ⅳ(COX)、caspase-3、caspase-9、a-tubulin(a-微管蛋白)、硝基酪氨酸等蛋白表达。6Caspase活性检测：检测caspase-1、2、3、9的活性。7采用激光共聚焦成像技术鉴别新生细胞的分化类型。8细胞计数：高倍视野下在皮层、纹状体、海马、丘脑分别计数免疫组化阳性细胞，海马区Brdu阳性细胞采用立体测量学系统计数。9脑梗塞体积测定：采用Micro Image软件测量MAP-2丢失面积，依据公式计算脑梗塞体积。10统计学处理：两组间比较采用t检验，多组间比较采用ANOVA post Hoc检验，用StatView软件处理，P<0.05为有显著性差异。 结果：缺氧缺血性脑损伤后细胞死亡机制的研究1．凋亡相关蛋白在正常脑组织发育中的变化：脑组织发育期间，AIF水平保持不变。线粒体标记物即线粒体膜结合蛋白细胞色素C氧化酶(COX)以及细胞色素C、caspase-9随脑组织发育表达增高，caspase-3随脑发育高峰期的消退而减少。2．HI后AIF、细胞色素C的释放：HI后即刻AIF跨膜核转移，HI后8h达到峰值，细胞呈凋亡形态学改变， AIF从线粒体的释放早于早于细胞色素C核转移，且AIF核转移早于DNA断裂。3．Caspase广谱抑制剂对AIF的再分布无作用，说明AIF通过caspase非依赖途径发挥作用。4．硝基酪氨酸免疫组化结果： HI后30min，在损伤侧大脑半球(皮层、纹状体、海马和丘脑)即可见到硝基酪氨酸着色明显增强， HI后3h达到峰值，而后下降。其中在皮层，部分阳性细胞在HI后72h再次出现；在室管膜下HI·侧和对侧(单纯缺氧侧)均检测到强烈的硝基酪氨酸免疫反应性。5．硝基酪氨酸形成早于AIF的核转移和caspase-3的激活。6．硝基酪氨酸形成早与DNA断裂，硝基酪氨酸阳性细胞位于MAP-2的阴性区(梗塞区)。7．nNOS和iNOS联合抑制剂2-亚氨基生物素在HI后减少硝基酪氨酸形成，降低caspase-3的活性，但对AIF跨膜核转移无作用。正常脑组织发育过程中以及HI脑损伤后细胞增生与分化的研究1．HI对小鼠皮层和纹状体细胞增生的影响：随着脑组织发育，Brdu标记的细胞在皮层和纹状体显著下降。HI损伤显著增加未成熟脑(P9)恢复早期(HI后1w)皮层和纹状体的Brdu阳性细胞数；在青少年期组(P21)，大量的新生细胞仅发现于HI损伤侧的纹状体区。2．HI对小鼠皮层和纹状体新生细胞分化的影响：在未成熟脑皮层恢复早期以及各组的纹状体区仅能检测到少部分Brdu/NeuN双染色细胞，大部分的Brdu标记细胞为神经胶质细胞，神经胶质细胞数随脑组织发育成熟快速降低，未成熟脑皮层和纹状体在HI恢复早期被激发产生大量神经胶质细胞，在青少年期脑纹状体区，HI后Ibal(小胶质细胞)和S100β(星形胶质细胞)阳性细胞分别增加50倍和8倍，但APC(少突细胞)阳性细胞数无显著改变。3．HI对脑发育期海马细胞增生的影响：P9脑组织中Brdu标记细胞数的基线显著高于P21组。HI损伤明显增加P21整个海马区Brdu标记细胞，P9脑组织DG区无变化。4．HI对脑发育期海马新生细胞分化的影响：P9脑组织中神经元细胞再生的基线显著高于P21组。HI后，与正常对照组比较，P21组神经元再生显著增高，而在P9组无明显改变。新生神经元细胞数绝对值在两年龄组间无差别。新生的小胶质细胞和少突细胞在P21组多于P9组。 结论：1．AIF核转移是新生大鼠脑缺氧缺血后神经细胞损伤的早期指标，AIF介导的细胞死亡途径在未成熟脑神经细胞损伤中起重要作用。2．硝基酪氨酸是新生大鼠脑缺氧缺血后细胞损伤的早期指标；联合抑制nNOS和iNOS在新生脑缺氧缺血损伤中发挥神经保护作用。3小鼠脑组织细胞增生、分化以及存活与脑组织区域、发育时期以及损伤时程相关。4海马区年龄相关的神经细胞再生和胶质细胞再生的不同导致缺氧缺血损伤后组织修复的不同。

目录

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声明

前言

材料与方法

1缺氧缺血模型的制备

2缺氧缺血性脑损伤后细胞死亡机制的研究

2.1动物分组及标本制备

2.2给药方法及药物来源

2.3免疫组化检测

2.4免疫荧光双染色

2.5 Western蛋白印迹

2.6 Caspase活性检测

2.7细胞计数及图像分析

2.8脑损伤梗塞体积测量

3脑发育期HI后神经细胞增生与分化的研究

3.1动物分组

3.2给药方法

3.3标本制备

3.4各观察指标的检测

3.5 Brdu阳性细胞计数

3.6采用激光共聚焦成像技术鉴别新生细胞的分化类型

4统计学分析

结果

1缺氧缺血性脑损伤后细胞死亡机制的研究

1.1凋亡相关蛋白在脑发育中的变化

1.2 HI后AIF、细胞色素C的释放

1.3 Caspase非依赖的细胞死亡

1.4硝基酪氨酸免疫组化结果

1.5硝基酪氨酸与AIF的核转移

1.6硝基酪氨酸与caspase-3激活

1.7硝基酪氨酸与DNA断裂和神经元损伤的相关性

1.8 2-亚氨基生物素在硝基酪氨酸形成、caspase-3激活以及AIF核转移中的作用

2脑发育期及HI后神经细胞增生与分化的研究

2.1 HI对脑组织发育期间皮层和纹状体区细胞增生的影响

2.2 HI对脑组织发育期间皮层和纹状体新生细胞分化的影响

2.3HI对海马神经细胞增生的影响

2.4 HI对海马神经新生细胞分化的影响

讨论

缺氧缺血性脑损伤后细胞死亡机制的研究

1 AIF在正常脑组织中的表达变化

2 HI后AIF的释放与核转移

3AIF与DNA损伤的相关性

4 Caspase非依赖性的细胞死亡

5 HI后硝基酪氨酸的表达以及与DNA损伤的关系

6 HI后硝基酪氨酸与AIF核转移和caspase-3激活的相关性

7 HI后iNOS和nNOS联合抑制剂的保护作用

脑发育期以及HI后神经细胞增生与分化的研究

1脑组织发育过程中细胞增生和分化

2 HI后细胞增生和分化

3新生儿期与青少年期海马区细胞增生与分化比较

结论

参考文献

综述 缺氧缺血脑损伤后细胞死亡与再生

致谢

发表论文一

发表论文二

发表论文三

发表论文四