胶体金免疫层析试纸条用于旋毛虫病诊断及检疫的研究

摘要

旋毛虫病(trichinellosis)是由旋毛虫(Trichinellaspiralis)引起的一种严重的人兽共患寄生虫病。旋毛虫寄生的宿主范围广泛，可感染人及其他150多种动物。目前全世界大约有1100万人体感染者，1995-1997年国际旋毛虫病委员会报道1万多例病人，现已被列入再度肆虐的疾病(re-emergingdisease)。本病不仅对人类的健康构成严重威胁，而且给养猪业和和肉类出口也造成重大的经济损失。国内外学者对旋毛虫病的免疫诊断方法进行了大量研究，已建立的旋毛虫病检测方法有间接荧光抗体试验、酶联免疫吸附试验等，但操作较复杂且需一定的仪器设备，在推广应用方面受到了一定的限制。因此，建立一种快速简便、特异敏感的旋毛虫病检测方法，不仅可用于人及动物旋毛虫病的血清学诊断及流行病学调查，也可用于肉类及肉制品中旋毛虫的检疫，是目前旋毛虫病防治工作中亟待解决的问题之一。 本研究以胶体金标葡萄球菌蛋白A(SPA)和旋毛虫肌幼虫排泄分泌(excretorysecretory，ES)抗原建立了免疫层析试纸条，用于检测样本中的旋毛虫抗体。由于SPA可与人及多种动物IgG的Fc段相结合，故该试纸条不仅可用于人旋毛虫病的血清学诊断，也可用于多种动物旋毛虫病的检测。 材料与方法 1.制备旋毛虫ES抗原：将旋毛虫肌幼虫在1640培养基中于5％CO2培养箱中培养18～20h，收集上清，透析和冷冻干燥后得到纯化ES抗原；测蛋白浓度后-80℃保存。 2.胶体金标记SPA：用枸橼酸三钠(Na3C6H5·7H2O)还原氯金酸(HAuCl4)，制备颗粒直径为15nm的胶体金溶液，冷却至室温后，以0.2mol/L的K2CO3溶液调节其pH值至6.0，4℃保存。测定胶体金的最适SPA标记量，制备胶体金标SPA，用玻璃纤维吸附标记物并冷冻干燥，密封保存于4℃。 3.胶体金免疫层析试纸条制备：用PBS将ES抗原和人IgG均稀释至2mg/mL，在硝酸纤维素膜(NCM)上包被检测(test，T)线和质控(control，C)线，室温干燥后用3％的脱脂奶粉封闭；将样品垫、结合垫、包被好的NCM、吸水材料组装在支持板上，并切割成3mm宽的试纸条，即为胶体金免疫层析(colloidalgoldimmunochromatographicassay,GICA)试纸条，4℃密封保存。 4.试纸条及检测结果保存时间的观察：将不同批次的试纸条分别保存于冰箱(4℃)及室温(25℃)，间隔不同时间后取出检测同一批样本，观察不同温度对试纸条保存时间的影响。检测过样本的试纸条干燥后室温保存，观察检测结果的保存时间。 5.试纸条的特异性、敏感性及稳定性观察：用试纸条分别检测旋毛虫感染小鼠血清及肉汁各94份、旋毛虫感染猪血清30份、旋毛虫病人血清20份，正常小鼠血清及肉汁各50份，观察试纸条检测旋毛虫病的特异性和敏感性。用6个不同批次的试纸条检测旋毛虫感染的小鼠血清72份，观察试纸条的稳定性。 6.肌肉保存不同时间后的检测：用试纸条对感染旋毛虫的小鼠肌肉在4℃保存1周和-20℃保存1～7个月的肉样各72份进行检测。 7.试纸条与ELISA及镜检法检测结果的比较：用试纸条与ELISA对感染旋毛虫后6周的小鼠血清及肉汁各94份进行同时检测；用试纸条对小鼠血清及肉汁进行同时检测；镜检法计数小鼠膈肌幼虫，消化小鼠胴体后收集并计数幼虫。 8.对其它种旋毛虫感染小鼠血清的检测：用试纸条对乡土旋毛虫、布氏旋毛虫、伪旋毛虫、纳氏旋毛虫感染的小鼠(300条幼虫/只)血清进行检测。 9.统计学处理：采用SPSS13.0统计分析软件进行数据处理和统计分析。阳性率的比较采用分类变量配对四格表x2检验方法。检验水准为α=0.05。 结果 1.胶体金免疫层析试纸条的制备：SPA最适标记量为1mL胶体金需要6μgSPA，旋毛虫肌幼虫ES抗原最佳包被浓度为2mg/mL，SPA金探针最佳浓缩度为20％，ES抗原和人IgG最适搭配浓度均为2mg/mL。在室温条件下上样后15min内可观察结果。 2.试纸条的敏感性和特异性：试纸条对旋毛虫病患者、旋毛虫感染小鼠及猪血清的检出率分别为100％(20/20)和97.87％(92/94)及100％(30/30)。正常人(20例)、小鼠(50只)及猪(30只)血清均为阴性；肝吸虫病(10例)、肺吸虫病(10例)、血吸虫病(15例)、囊虫病(10例)及包虫病(5例)患者血清均为阴性；弓形虫、人芽囊原虫、隐孢子虫感染小鼠血清各2份均为阴性，表明试纸条具有高度敏感性和特异性。 3.试纸条与ELISA结果的比较：ELISA和试纸条对感染100条幼虫的小鼠血清检测的阳性率分别为95.7％(22/23)和91.3％(21/23)(P＞0.05)；对小鼠肉汁的检出率分别为100％(23/23)和91.3％(21/23)(P＞0.05)。ELISA和试纸条对每只小鼠感染200条幼虫(10只小鼠)、300条幼虫(20只小鼠)、500条幼虫(41只小鼠)的血清及肉汁的检出率均为100％，50只正常小鼠血清及肉汁均为阴性。 4.试纸条与镜检结果的比较：感染小鼠后5-7周肌肉压片镜检法和试纸条对肉汁的检出率均为98.6％(71/72)，每克肌肉中仅有6条幼虫时亦能被试纸条检出。 5.试纸条的稳定性：该试纸条在4℃保存1年、在室温(25℃)保存3个月对检测结果无影响；检测过的试纸条室温保存12周后检测结果仍清晰可见。用6个不同批次的试纸条对72份感染旋毛虫的小鼠血清进行检测，结果相同。 6.肌肉保存不同时间后的检测结果：试纸条对感染100条旋毛虫的小鼠肌肉4℃保存1周和-20℃保存1～7个月的检出率均为91.6％(22/24)，感染300、500条旋毛虫的小鼠肌肉4℃保存1周和-20℃保存1～7个月的检出率均为100％(24/24)。表明感染旋毛虫的肉样4℃保存1周和-20℃保存7个月不影响检测结果，该试纸条可用于新鲜肉、冷藏及冷冻肉中旋毛虫的检疫。 7.对其它种旋毛虫感染的检测：对乡土旋毛虫、布氏旋毛虫、伪旋毛虫、纳氏旋毛虫感染的小鼠(300条幼虫/只)血清(20份、8份、8份及12份)，用试纸条进行检测，阳性率均为100％。 结论 1.以胶体金标SPA建立的免疫层析试纸条具有较高的敏感性和特异性，操作简单，15min可观察结果。可替代ELISA可用于人及多种动物旋毛虫病的血清学诊断及流行病学调查，可用肉汁替代血清作为检测样本。 2.该试纸条可替代镜检法对肉类中的旋毛虫进行检疫，每克肌肉中仅有6条幼虫时亦能被试纸条检出。 3.该试纸条具有良好的重复性和稳定性，在4℃可保存1年、在室温(25℃)可保存3个月。检测结果室温下可保存3个月。 4.感染旋毛虫的小鼠肌肉在4℃保存1周和-20℃保存7个月对检测结果无影响，该试纸条可用于新鲜肉、冷藏及冷冻肉中旋毛虫的检疫。 5.该试纸条可用于多种旋毛虫(乡土旋毛虫、布氏旋毛虫、伪旋毛虫、纳氏旋毛虫)感染的检测。

目录

文摘

英文文摘

郑重声明

1前言

2材料和方法

3结果

4讨论

5结论

参考文献

免疫胶体金技术在寄生虫病诊断中的应用

英文缩写词索引

致谢