鼠疫F1抗原的磁粉球-ELISA和免疫-PCR检测技术的建立

摘要

鼠疫(plague)是鼠疫耶尔森氏菌引起的以跳蚤为媒介的在温血动物尤其是啮齿类动物间流行的自然疫源性疾病，同时也是危害严重的人兽共患病。在世界范围内均有其疫源地分布。历史上曾3次出现鼠疫大流行，死亡人数数以千万计。目前其流行呈现以下特点：流行范围有所扩大，疫情有上升趋势；某些疫区间隔多年后又出现小面积暴发；疫区有向城市和人口密集区蔓延的趋势；主要宿主数量明显回升，某些地区动物鼠疫重新发生。在我国，1978～1997年共有云南、西藏、青海、甘肃、新疆、内蒙古六省发生人间鼠疫456例，死亡105例，病死率达23.03％；其中1978～1987年发生106例，1988～1997年发生350例，后10年是前10年的3.3倍，呈明显上升趋势；发病地区主要是旱獭疫源地和黄胸鼠疫源地。“十五”期间，共有7省(区)43县发生人间鼠疫206例，14省(区)278县次发生动物鼠疫疫情，其中13个为新增鼠疫疫源县。因此对鼠疫快速准确的诊断显得尤为重要。传统的显微镜观察、培养、噬菌体裂解和动物实验4步检测法，耗时较长，步骤繁琐，不能满足现场流行病学调查需要。随着免疫学等技术的发展，针对鼠疫各种特异性抗原、毒力因子及其抗体的新的诊断方法不断涌现，如间接血凝法(Indirect hemagglutination assay,IHA)、酶联免疫吸附试验(Enzyme LinkedImmunosorbcnt Assay,ELISA)、斑点酶联免疫吸附试验(DOT-ELISA)、放射免疫沉淀法(Radioimmuno Precipitation Test，RIP)等。许多蛋白和因子被选为这些诊断方法的标靶，如pgm、pst、Yops、F1抗原、V抗原等。其中F1抗原是鼠疫菌的特异性抗原，也是被证实的保护性抗原。鼠疫菌F1抗原是存在于鼠疫菌体表面的荚膜物质，由分子量为61-65MD的质粒编码，在37℃培养时可以产生。实验表明，从大肠杆菌重组株中纯化的F1抗原能保护小鼠对抗经皮下或吸入途径的强毒菌的攻击，因此针对F1抗原或抗体的检测成为鼠疫诊断方法研究的热点。 赵旭东等根据某些高分子化学物质的聚合性质，结合免疫亲和层析和磁学原理研制出磁粉球。通过使用抗原(或抗体)对磁粉球致敏，即可应用于其对应的抗体(或抗原)的筛选和纯化，从而实现液体介质中某些抗原或抗体的富集，提高检测的阳性率。国外一些文献报道应用磁性吸附颗粒可以实现对某些蛋白、细胞因子甚至核酸的分离和纯化。目前，国内也有个别学者尝试应用国外磁珠产品分离、检验肿瘤细胞，但磁粉球的自主生产及应用于纯化和检测抗原(或抗体)的研究国内尚未见报道。 免疫-PCR(immuno polymerase chain reaction，I-PCR)是1992年Sano T等建立的一种微量抗原检测技术。该技术的基本原理是将一段生物素标记的已知序列的DNA分子特异性的连接到抗原一单克隆抗体复合物上，PCR扩增该DNA片段，通过电泳定性分析，根据特异性PCR产物的有无来判断待测抗原是否存在。该技术把抗原抗体反应的高特异性和聚合酶链反应的高敏感性有机结合起来，其本质是一种以PCR扩增一段DNA报告分子代替酶反应来放大抗原抗体结合率的一种改良型ELISA。由于该方法同时具备免疫学抗原抗体反应的高特异性和分子生物学PCR技术的强大扩增能力，必将在疾病的诊断，特别是极微量抗原检测中发挥巨大的作用。目前，将免疫-PCR应用于鼠疫检测的研究尚未见报道。 本研究拟通过制备磁粉球及抗鼠疫F1单克隆抗体(McAb)，创建针对鼠疫F1抗原的磁粉球-ELISA和免疫-PCR检测方法；并通过对鼠疫F1抗原检测，就其敏感性、稳定性、实用性和操作的简便情况与夹心-ELISA、生物素-ELISA(ABC-ELISA)进行综合比较，以确定这两种检测方法在临床和流行病学调查中应用的可行性，以期找到一种简洁、高效、准确率高的血清学诊断方法，并对其应用前景进行初步评价。 方法: 采用聚合法研制磁粉球，将磁粉、苯乙烯、甲苯、反丁烯二酸、对二甲苯搅拌混匀后，置分散液中，在催化剂作用下，于80～90℃温度下高速搅拌、洗涤、分离，于-20℃、-5℃和4℃存放条件下观察磁粉球放置1～6个月的理化稳定性。 将鼠疫F1抗原加入含碳二亚胺的磁粉球PBS混合液，4℃放置48h形成致敏磁粉球。将待提纯鼠疫抗体加入致敏磁粉球中，37℃摇床振摇1h，洗涤，pH2.5～2.8甘氨酸盐酸解离透析。 常规方法制备抗鼠疫F1抗原特异McAb，应用磁粉球进行纯化，间接ELISA法检测其抗体滴度，布鲁氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌O<,3>、O<,9>、伤寒杆菌、霍乱弧菌、痢疾杆菌、出血大肠杆菌、致病大肠杆菌抗原作包被抗原检测其特异性。采用棋盘滴定法，确定最佳多抗包被浓度、单抗和亲合素稀释浓度，应用常规夹心ELISA和ABC-ELISA法，检测不同浓度的鼠疫F1抗原。 磁粉球-ELISA检测方法为：将抗鼠疫F1抗原McAb致敏的磁粉球加入含鼠疫F1抗原待测样本的Ep管内，37℃轻度涡式摇动40min，以后各步骤与常规ELISA基本相同，不同点为各步骤均要轻度涡式摇动，且需应用磁铁吸附磁粉球结合PBS-T<,20>进行洗涤。将其敏感度、稳定性与上述3种实验方法进行对比。 以生物素标记M13-20(Bio-5’-GTAAAACGGCCAGT-3’)为上游引物，无生物素标记M13(5’-GGAAACAGCTATGACCATG-3’)为下游引物，构建生物素标记DNA探针，目的片段长度为227bp，I-PCR法检测鼠疫菌不同浓度的F1抗原。 结果: 研制出的磁粉球是直径为0.5～2.0μm的球状体，比重1.07～1.15， -5℃和4℃条件下存放6个月，加入硫酸后质量分别减少10％和6％； 经F1抗原致敏后纯化抗鼠疫F1 McAb的量最高达1.9mg/g；F1抗原致敏的磁粉球-5℃和4℃存放6个月后，纯化抗体量分别减少5.3％和26％； 制备的抗鼠疫F1 McAb，为IgG1亚型，滴度为1：1×10<'6>，与布鲁氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌O3、O9等无交叉反应； 夹心-ELISA的最适多抗稀释比例为1：1000，单抗稀释比例为1：2000，可检测到的最低鼠疫F1抗原浓度为0.032μg/ml，平行对照OD值差异<0.034，重复3次，检测到的最低抗原浓度不变； ABC-ELISA的最适亲合素浓度为1μg/ml，可检测到的最低鼠疫抗原浓度为0.004μg/ml，平行对照OD值差异<0.063，重复3次，检测到的最低抗原浓度不变； 磁粉球．ELISA检测到的最低抗原浓度为0.002μg/ml，平行对照OD值差异<0.031，重复3次，检测到的最低抗原浓度不变； I-PCR的最适亲合素浓度和生物素标记DNA探针浓度为10ng/ml和10pg/ml，可检测到最低鼠疫F1抗原浓度可达5pg/ml，5次重复实验，2次有假阳性条带出现； 结论:本实验研制的磁粉球在抗原、抗体的纯化和疾病的免疫学诊断方面，具有广阔的开发应用前景；所制备的抗鼠疫F1抗原McAb通过致敏磁粉球纯化后，纯度高、特异性强； 所建立的磁粉球-ELISA法检测样本量大、稳定性好、灵敏度高，与夹心．ELISA和ABC-ELISA相比，有一定优势，经过进一步完善和临床检验后有可能在大面积流行病学调查中得到广泛应用； I-PCR法灵敏度很高，但操作过程复杂，耗时较长，容易污染，对实验条件要求较高，优化和改进其操作步骤后，有可能在实验室研究特别是极低浓度抗原检测方面发挥作用。

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文摘

英文文摘

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前 言

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

参考文献

综述：Immuno-PCR的研究进展

致 谢