盐酸安妥沙星对HERG钾电流的影响

摘要

研究背景及目的:HERG(human ether a-go-go related gene)基因,最初发现于人脑的海马组织,其编码的钾离子通道称为HERG钾离子通道。随后的研究发现HERG主要在心肌细胞表达,编码快速延迟整流钾电流IKr的α亚基,在维持心肌细胞动作电位3期复极化钾离子外流过程发挥重要作用。其公认的辅助亚单位MiRP1(minK-related protein1)含有123个氨基酸,只有1个跨膜结构域,不能单独构成功能性通道,但可与HERG通道蛋白形成稳定的复合物。已有不少证据表明,HERG钾通道与LQTS(long QT syndrome)有密切的关系。LQTS可以分为遗传性和获得性两种类型,前者主要是由于编码HERG钾通道的基因突变,导致通道功能异常或缺失:后者则是因为药物对离子通道的阻断作用及影响蛋白表达,严重时二者均可引起心肌动作电位复极过程和QT间期延长,进而易促发尖端扭转型室速(Tdp),导致晕厥和猝死。HERG钾通道内腔的两个芳香族氨基酸与许多药物高度亲和,成为绝大多数获得性LQTS的靶通道。药物抑制HERG钾电流是获得性LQT综合征致心律失常的主要原因。
　　目前,有报道指出多种非心血管系统药物,如抗精神病药、抗菌药、抗抑郁症药、抗疟疾药和抗肿瘤药等都可通过与HERG钾通道内腔的芳香族氨基酸结合,不同程度地抑制通道的钾离子流,而引起QT间期延长。因此,近年来在新药研发过程中,药物对HERG钾离子通道电流的阻滞作用就成为安全评价的重要指标之一,也成为临床工作者和基础研究人员关注的焦点问题。氟喹诺酮类抗菌药是广泛用于感染性疾病的第三代喹诺酮类抗菌药。其共同的结构特征是:萘啶环的6位处引入了氟原子,7位上都连有哌嗪环。因其口服易吸收,分布广,且扩大和增强了抗菌活性而在临床上广泛应用。但近年来随着研究的进一步深入,发现氟喹诺酮类抗菌药物可以抑制延迟整流钾电流IKr的内流,从而使心肌复极化3期延长,导致QT间期延长,进而诱发LQTS。最近,来自动物实验的报告指出,氟喹诺酮类药物的代表药物之一司帕沙星(Sparfloxacin,SPX)相继在家兔和人,被发现可以显著引起心电图QT间期延长,心肌细胞动作电位时程的延长;并且因此而退出欧美市场。盐酸安妥沙星(Antofloxacin,AX)是我国自主创新、开发研制的第三代氟喹诺酮类抗菌药,其对延迟整流钾电流的抑制作用尚不清楚。而乳酸左氧氟沙星(Levofloxacin,LVFX)是AX的修饰前体物,现正广泛应用于临床。而我们前期的动物实验证明LVFX和AX均可抑制豚鼠心室肌细胞IK,导致QT间期延长,但其抑制程度均小于SPX;而AX与LVFX相比,抑制程度更小;但据文献报道,IK由快激活的延迟整流电流IKr和慢激活的延迟整流电流IKs组成,在豚鼠心室肌细胞上是以复合形式存在的IK,利用药物很难将两种成分区分开,因此无法确定两种药物究竟作用哪一组分或是二者兼有。而我们利用常规细胞内微电极记录发现,AX可以延长豚鼠心肌细胞动作电位APD90,这种延长可被IKr的特异阻断剂E-4031处理所取消,而几乎不受IKs特异阻断剂Chromanol293B的影响,提示LVFX和AX很可能通过IKr发挥抑制作用。
　　为了直接观察盐酸安妥沙星(AX)对HERG钾通道电流的影响,评价其是否具有引起获得性LQTS的潜在危险性,本课题利用全细胞膜片钳记录技术在HEK293细胞(人胚肾上皮细胞)观察不同浓度的AX对外源表达的HERG钾通道电流IHERG/MiRP1的影响,了解AX作用的浓度依赖性以及IC90,以相应浓度的司帕沙星作阳性对照,同时观察比较AX的修饰前体物乳酸左氧氟沙星对IHERG/MiRP1的影响,比较三种药物对HERG钾电流抑制作用的强弱,为临床合理用药提供充分的实验依据和理论基础。为避免MiRP1亚基对通道电流的影响,还观察了单独表达HERG通道时,AX对IHERG的作用。
　　方法:1.大量提取并纯化质粒;磷酸钙法转染常规培养的HEK293细胞36~48hr后用于实验观察。
　　2.在倒置显微镜下,选取可见绿色荧光的细胞(说明质粒转染成功并表达)进行钳制。形成高阻抗封接并破膜后,在全细胞模式下记录IHERG/MiRP1,连续观察记录5min作为加药前的空白对照。
　　3.按照所需浓度取适量已配制药物的母液直接滴加至培养皿,观察加药5分钟后IHERG/MiRP1电流大小的变化,以及药物作用的浓度依赖性。AX、LVFX和SPX的工作浓度均为0.001μM、0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM、103μM、104μM。
　　4.实验数据用Clampfit10.0和/或Origen6.0作统计学分析处理,以Mean±S.E.M.表示,加药前后自身对照采用配对t检验。同一药物不同药物浓度间差异的比较或同一浓度不同药物检差异的比较采用单因素方差分析及两两比较q检验,P<0.05视为差异有显著性。
　　结果:1.与MiRP1亚基共表达时药物对IHERG/MiRP1的作用
　　1.1.盐酸安妥沙星对IHERG/MiRP1的抑制作用低浓度(0.001~0.1μM)AX对IHERG/MiRP1没有明显的抑制作用,随着药物作用浓度增加(1μM时),抑制作用逐渐加强,不仅表现在对脉冲电流,而且表现在对尾电流的抑制。但这种抑制作用不改变IHERG/MiRP1通道的电压和时间依赖性,也不影响通道的激活和失活过程。在作用浓度为1μM时,分析不同电压下脉冲电流的变化,结果显示去极化电压在+20~+60mV时对脉冲电流的抑制尤为显著(P<0.05),而对尾电流的抑制作用在去极化电压为+20~+80mV时具有显著性。
　　1.2.乳酸左氧氟沙星对IHERG/MiRP1的抑制作用LVFX对IHERG/MiRP1的脉冲电流和尾电流也呈浓度依赖地抑制。对应于所给同一测试电压,低浓度的LVFX对IHERG/MiRP1的脉冲电流没有明显的抑制作用,随着浓度的增加,LVFX对IHERG/MiRP1的脉冲电流和尾电流均呈浓度依赖的抑制,不影响通道的激活和失活过程。与AX不同的是,LVFX对电流产生抑制的起始浓度为0.1μM,而1μM LVFX对脉冲电流的抑制作用在去极化电压0~+40mV范围内最为明显,而对尾电流的抑制则在去极化电压为+10~+80mV范围内最为显著。
　　1.3.司帕沙星对IHERG/MiRP1的抑制作用SPX浓度依赖地抑制IHERG/MiRP1电流。而且在相同测试浓度下,其对IHERG/MiRP1的抑制作用明显大于AX和LVFX。在同样的测试条件下,低浓度的SPX对IHERG/MiRP1略有抑制,但差异没有显著性(P>0.05);当浓度增加至0.1μM以上时,所记录IHERG/MiRP1的脉冲电流和尾电流分别受到显著抑制,并随剂量的增加其抑制作用明显增强。在同一作用浓度下,随着去极化刺激达0mV以上,司帕沙星明显抑制脉冲电流和尾电流,与用药前对照相比,差异有显著性(P<0.01)。
　　1.4.三种药物作用的比较三种药物均不同程度的抑制IHERG/MiRP1的脉冲电流及尾电流,且均呈浓度依赖性,表现为电流幅值减小,I-V曲线下移。从脉冲电流及尾电流的药物作用量效曲线上可以看出,相同浓度下,SPX对IHERG/MiRP1作用后抑制程度最强,其次是LVFX,而AX作用后抑制程度最轻。通过Logistic方程计算得出AX、LVFX、SPX对脉冲电流作用的IC50的值分别为:336.8μM,46.39μM,1.21μM;对尾电流作用的IC50的值分别约为:460.37μM,43.86μM,2.69μM。可知相同浓度下,AX对HERG钾电流的抑制作用明显低于SPX及LVFX。但三种药物均不影响通道的激活及失活过程,加药前后激活、失活曲线的差异作统计学分析,无显著性。
　　2.盐酸安妥沙星对IHERG的作用
　　2.1.MiRP1亚基对HERG通道电生理特性的影响单独表达HERG钾通道与共表达MiRP1亚基时记录到的电流相比,IHERG在0mV时电流达最大(IHERG/MiRP1在+10mV达最大);Bolzman方程拟合出通道的激活和失活曲线均向左移,说明MiRP1亚基可使HERG通道的激活、失活过程向去极化方向移动。
　　2.2.1μM盐酸安妥沙星对IHERG的作用与其自身对照相比,1μM AX作用后电流密度减小;绘制的I-V曲线下移,对脉冲电流的抑制作用在0mV、+10mV差异有显著性(P<0.05),对尾电流的抑制作用在+10mV-+40mV时,差异有显著性(P<0.05)。但激活及失活曲线与加药前相比,基本没有变化。1μM AX分别对IHERG/MiRP1及IHERG的抑制作用,组间比较差异没有显著性,即MiRP1亚基存在与否不影响本实验中三种药物对通道电流的作用。
　　结论:1.盐酸安妥沙星、乳酸左氧氟沙星、司帕沙星对IHERG/MiRP1电流,包括脉冲电流和尾电流均有浓度依赖地抑制作用,并且盐酸安妥沙星对IHERG/MiRP1的抑制作用明显低于阳性对照司帕沙星,也低于其修饰前体物乳酸左氧氟沙星。
　　2.三种测试药物对HERG钾电流的抑制作用不改变通道的电压依赖性及时间依赖性,也不影响通道的激活及失活过程。
　　3.MiRP1亚基可使HERG钾通道的电压依赖性激活、失活曲线向去极化方向偏移,但在本实验中并不影响药物对HERG通道的抑制作用。

目录

摘要

Abstract

论文部分 盐酸安妥沙星对HERG钾电流的影响

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

综述部分 HERG钾离子通道与LQTS

参考文献

缩写词索引

致谢