一株对烟草甲高毒力苏云金芽孢杆菌的筛选与鉴定

摘要

烟草甲(Lasioderma serricorne)是一种世界性的重要仓储害虫。每年全球由这种害虫所造成的损失达上亿美元。常规的防治方法,对烟草甲产生了抗药性,且污染环境。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis简称Bt)是目前防效显著、应用最广泛的微生物杀虫剂。从上个世纪九十年代开始,世界各国的学者已经开始致力于苏云金芽孢杆菌对烟草甲的防治研究。
　　本研究从土壤、烟叶、植物叶片三个方面准备菌源材料258份,利用醋酸钠抑制法从中分离出19株含有伴孢晶体的苏云金芽孢杆菌,晶体形态以菱形为主,并有少量矩形存在。总检出率为7.36％。三种材料中,烟叶样品检出率最高为13.33％,充分说明了烟叶是Bt生存的重要生境之一。在30℃,RH75％的条件下,利用饲喂食料(玉米面与酵母提取物按10∶1的比例混合)配成饲料成功地培育出烟草甲。试验结果显示饲料的营养成分与物理性状可能会对烟草甲生长造成一定的影响。
　　用培养出的烟草甲2-3日龄幼虫与分离的Bt菌株进行生物测定,初筛出6株对烟草甲幼虫具有高毒力的Bt菌株,编号分别为115、106、119、117、121、207第10天的校正死亡率分别为48.28％、55.17％、58.82％、68.97％、51.73％与48.28％。复筛后,这6株第12天的校正死亡率分别为48.28％、51.73％、58.62％、72.41％、51.73％、44.83％致死中浓度(LC50)分别为43.89057、42.60283、38.64439、29.02226、43.72312、52.42485mg/L,编号为117菌株杀虫作用最好,是作者要筛选的对烟草甲具有高毒力的菌株。随后对菌株Bt117进行了形态、生理生化特性与16s rDNA的鉴定。
　　鉴定结果表明:该菌营养体形态为杆状,两端钝圆,单个或多个排列成链状;晶体为菱形、大小不一;菌落圆盘状、颜色乳白、表面有放射性皱纹;所测得的生理生化特性与苏云金芽孢杆菌特性吻合;测得该菌16SrDNA序列与Bacillus thuringiensis strain2000031482等苏云金芽胞杆菌的几个模式序列的相似度高达99％;初步判定菌株Bt117是苏云金芽孢杆菌。

目录

摘要

Abstract

引言

1 文献综述

1.1 烟草甲简介

1.1.1 烟草甲的形态特征

1.1.2 烟草甲的生活习性

1.1.3 烟草甲生存的重要影响因素

1.2 烟草甲防治的必要性与紧迫性

1.3 烟草甲防治的常用方法

1.3.1 物理防治

1.3.2 化学防治

1.3.3 生物防治

1.4 苏云金芽孢杆菌简介

1.4.1 苏云金芽孢杆菌形态特征

1.4.2 苏云金芽孢杆菌的分布

1.4.3 苏云金芽孢杆菌的分类

1.5 苏云金芽孢杆菌的杀虫毒素及杀虫机理

1.5.1 δ-内毒素

1.5.2 β-外毒素

1.5.3 Vip

1.5.4 δ-内毒素的杀虫机制

1.6 苏云金芽胞杆菌的分离

1.6.1 温度筛选

1.6.2 利用醋酸钠进行选择筛选

1.6.3 弹土分离法

1.6.4 抗生素选择性筛选

1.7 苏云金芽孢杆菌的鉴定

1.7.1 生理生化鉴定

1.7.2 血清型鉴定

1.7.3 16SrRNA基因鉴定的方法

1.8 苏云金芽孢杆菌国内外研究现状分析

1.9 苏云金芽孢杆菌对烟草甲的防治研究

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 试验仪器

2.1.2 菌源材料

2.1.3 主要试剂

2.2 方法

2.2.1 烟草甲的饲养

2.2.2 苏云金芽孢杆菌的分离

2.2.3 苏云金芽孢杆菌的纯化

2.2.4 苏云金芽孢杆菌的保存

2.2.5 对烟草甲高毒力的苏云金芽孢杆菌的筛选

2.2.6 菌株Bt117的形态鉴定

2.2.7 菌株Bt117的生理生化鉴定

2.2.8 菌株Bt117的16S rDNA鉴定

2.2.9 菌株Bt117生长曲线的测定

3 结果与分析

3.1 饲养条件对烟草甲的影响

3.1.1 不同食料对烟草甲的影响

3.1.2 不同培养条件对烟草甲的影响

3.2 不同样品中苏云金芽孢杆菌的分离结果

3.3 伴孢晶体的形态特征

3.4 对烟草甲高毒力的苏云金芽孢杆菌的筛选

3.4.1 初筛结果

3.4.2 复筛结果

3.4.3 复筛菌株的LC_(50)测定结果

3.5 菌株Bt117的形态特征

3.6 菌株Bt117的生理生化特性

3.7 菌株Bt117的16SrDNA鉴定结果

3.7.1 16SrDNA基因的PCR扩增

3.7.2 pMD19-T-16S rDNA重组质粒的鉴定

3.7.3 16S rDNA序列相似性的比较与系统进化树的构建

3.8 菌株Bt117的生长曲线特征

4 讨论

4.1 烟草甲的饲养

4.2 苏云金芽孢杆菌的分离

4.3 伴孢晶体的形态特征

4.4 对烟草甲高毒力苏云金芽孢杆菌的筛选

4.5 菌株Bt117的鉴定

5 结论

参考文献

致谢